復合益生菌劑量對小鼠生理特性和腸道菌群的影響

吳影,古紹彬,2,3*,吳昊天,周艷林,2,趙麗娜,2,李欣,2,李璇,3,郭金英,3

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471023) 2(河南省食品微生物工程技術研究中心,河南 洛陽,471023) 3(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心,河南 洛陽,471023)

益生菌是一種無侵襲性、無致病性的革蘭氏陽性細菌,與病原體和毒素競爭,黏附于腸上皮細胞,促進腸上皮細胞存活,增強屏障功能,并與免疫系統細胞(如樹突狀細胞)直接相互作用,從而調節機體免疫功能[1]。研究發現,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum299v)能增加黏蛋白Muc2 的表達量,并抑制致病菌黏附[2]。益生型大腸桿菌 Nissle 1917(EscherichiacoliNissle 1917)在治療潰瘍性結腸炎方面效果顯著,可通過Toll樣受體(Toll like receptor,TLR) TLR-2識別系統減少促炎細胞因子IL-2、IFN-γ 和 TNF-α的表達,及提高IL-10、IL-8和IL-1β的分泌量[3]。

然而,林顯華等[4]研究枯草芽胞桿菌B7對肉雞生長性能及免疫性能的影響,發現隨著枯草芽胞桿菌B7添加量的增加,肉雞的生長性能有所增加,但差異不明顯,且高劑量組并未起到促進作用。WEI等[5]研究益生菌LFB112對肉雞生長性能的影響時發現,隨著益生菌劑量的提高,肉雞日增重提高,但高劑量組肉雞日增重減少。WANG等[6]將乳酸菌按照高低劑量飼喂被產氣莢膜梭菌感染肉雞時,觀察到低劑量更能改善肉雞的脂肪代謝、肉品質和腸道滲透性。上述報道顯示高劑量益生菌喂養組未展現出更好的養殖促進效果。RAO等[7]發現腦模糊患者(長期使用益生菌)的小腸內有大量細菌繁殖,以及細菌發酵碳水化合物產生的D-乳酸,其對腦細胞具有暫時毒性,干擾認知、思維和時間感。當患者停止服用益生菌一段時間后,癥狀得以改善。2018年,ZMORA等發表在Cell雜志的研究顯示,益生菌在某些情況下對人體的益處很大,例如：患有腸胃炎或胃病的人以及當患者服用抗生素后,可食用益生菌來恢復腸道菌群[8]。但益生菌不可能對每個人產生相同效果,一刀切必需補充益生菌的觀念值得探討。

腸道菌群失調會影響機體健康,甚至導致多種疾病的發生,腸道菌群平衡狀態對維持機體健康十分關鍵,但益生菌的使用需根據個體特點及特殊需求選擇和確定使用劑量。目前,對單一菌株或簡單復合菌株的腸道調節作用研究報道較多,但很少關注益生菌使用劑量方面的研究。本研究考察了不同劑量復合益生菌對小鼠生理生長特性、血清生化指標、肝腎結構以及腸道菌群結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

假鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、植物乳桿菌(Laobacillusplantarum) HZLp-005、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei) HZLc-017、凝結芽胞桿菌(Bacilluscoagulans) CGMCC 9951,實驗室保藏。

1.1.2 實驗動物

40只6周齡SPF級BALB/C小鼠(雌雄各半、清潔級),鄭州伊美諾生物技術有限公司,SYXK(豫)2017—0005。普通飼料由鄭州伊美諾生物技術有限公司提供。

1.1.3 主要試劑

無水乙醇、甲醛、二甲苯等,天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

H1850R臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；奧林巴斯BX50顯微鏡,瑞戈(上海)實業有限公司；其他為實驗室常用儀器和設備。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種培養和富集

雙歧桿菌在液體MRS培養基中37 ℃ 培養24 h,植物乳桿菌HZLp-005、干酪乳桿菌HZLc-017在液體MRS培養基中37 ℃培養18 h,凝結芽胞桿菌CGMCC 9951在液體LB培養基中37 ℃培養16 h,以 3% 接種量連續活化傳代2～3次。將活化好的種子液4 000 r/min離心10 min,用生理鹽水洗滌2次,并重懸于生理鹽水中。將獲得的雙歧桿菌、植物乳桿菌HZLp-005、干酪乳桿菌HZLc-017和凝結芽胞桿菌CGMCC 9951按1∶1∶1∶1比例混合配置成濃度為108、109、1010CFU/mL的菌液。

1.3.2 動物實驗

將小鼠隨機分為4組,每組10只,分別為對照組(灌胃生理鹽水)、試驗組(灌胃高、中、低劑量復合益生菌),每只小鼠下午4點經口灌胃0.2 mL復合菌懸液,對照組小鼠每天灌胃等量生理鹽水,試驗期間各組小鼠均飼喂普通飼料,自由進食和飲水。小鼠喂養6周后,禁食12 h,處死前稱重。動物實驗所有操作符合實驗動物管理各項規定,許可證號：SYXK(豫)2017—0005。動物實驗方案經河南科技大學實驗動物福利與倫理審查批準。

1.3.3 血清生化指標分析

頸椎脫臼法致死小鼠后,主動脈取血,3 000 r/min離心6 min,分離得到小鼠血清并用全自動生化分析儀分析血清生化指標,其原理及實驗步驟根據試劑盒所附說明書進行。

1.3.4 小腸、肝臟、腎臟組織切片染色

小鼠處死后,立即將小腸上端腸段2～3 cm、肝臟、腎臟組織用10%甲醛溶液固定。將組織切成小塊放入包埋籠中沖洗,按照乙醇體積分數為70%、80%、95%(1)、95%(2)以及無水酒精進行梯度脫水。然后用二甲苯處理2次,進行包埋、切片、烤片,蘇木精染色10 min,蒸餾水返藍5～15 min,伊紅染液細胞質染色,中性樹膠封片,晾干鏡檢。

1.3.5 腸道微生物多樣性測定

小鼠腸道微生物多樣性測定樣品送至美吉生物科技有限公司進行測序分析。采用Illumina MiSeq高通量測序平臺測序。根據OTU分析結果,使用在線平臺軟件,對樣本進行物種注釋和多樣性分析。

1.4 數據統計分析

利用Origin統計分析軟件進行數據處理,每個實驗重復3次,最后用3個獨立實驗以平均值±標準差表示,各組數據間的差異用SPSS 19.0 軟件進行Duncan’s 多重比較分析,當P<0.05時視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌劑量對小鼠體重和飼料利用率的影響

由圖1-a所示,低劑量和中劑量組小鼠體重顯著高于對照組,而高劑量組小鼠體重增加不顯著。與WEI等[5]研究結果一致,過量添加益生菌并未能達到較好的效果。

C-對照組；L-低劑量組；M-中劑量組；H-高劑量組(下同) a-體重增加量；b-飼料利用效率圖1 復合益生菌劑量對小鼠體重增加量和飼料 利用率的影響Fig.1 Effects of compound probiotics on weight gain and feed efficiency in mice

圖1-b顯示,低劑量和中劑量組小鼠對飼料利用率顯著高于對照組,WANG等[9]研究也證實高劑量組的小鼠飼料利用率增加但不顯著,與本實驗結果一致。

2.2 血清生化指標檢測

血清生化指標是機體營養代謝、應激和健康狀態的綜合表征,血清中蛋白質含量可以反應機體內蛋白質的代謝水平[10],由表1可知,血清總蛋白、白蛋白與對照組差異不顯著,但都高于對照組,表明益生菌能夠增強蛋白質的代謝水平。丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)是肝細胞損害和壞死程度的敏感指標,測定臟器酶活性變化可分析益生菌干預劑量對臟器的損害程度。與對照組相比,高、中、低劑量組小鼠的總蛋白(total protein,TP)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein,HDL-C)含量均未出現明顯變化,各處理組間不存在顯著或極顯著差異,說明益生菌干預劑量未導致小鼠血液脂代謝的異常。益生菌添加組總膽固醇(total cholesterol,TC)較未添加組均呈降低趨勢,中劑量益生菌可有效降低小鼠血清中AST和ALT,而高劑量干預組則相反,血清中ALT和AST呈現顯著上升的現象。血清ALT、AST轉氨酶活性升高在一定程度上反映了肝細胞的損害和壞死程度,表明益生菌干預劑量過高可能會對肝臟有損傷。

表1 復合益生菌劑量對小鼠血清生化指標的影響Table 1 Effect of compound probiotics dosage on serum biochemical parameter in mice

2.3 復合益生菌劑量對小腸組織結構的影響

腸黏膜屏障是宿主對入侵的共生細菌和腸道病原體的第一道防線。由圖2可知,低劑量和中劑量組小鼠的小腸絨毛長度有顯著增加,說明益生菌能夠黏附于腸道上皮細胞,保護胃腸道黏膜。郭元晟等[11]發現發酵乳酸菌能夠顯著增加肉雞小腸絨毛的長度及隱窩的深度,但高劑量組肉雞的小腸絨毛較短,可能是由于腸道病原體增加,腸上皮細胞損壞導致的。

a-對照組;b-低劑量組;c-中劑量組;d-高劑量組圖2 復合益生菌劑量對小鼠小腸絨毛結構的影響Fig.2 Effect of compound probiotics dosage on villus structure of small intestine in mice

2.4 復合益生菌劑量對肝臟結構的影響

腸道屏障損傷會增加腸道通透性,導致細菌易位和脂多糖的積累,從而引起肝臟發病[12]。圖3小鼠肝損傷情況表明,對照組、低劑量組和中劑量組的小鼠肝小葉結構清晰,但高劑量組小鼠的肝臟周圍有輕微的纖維化,這可能是有害菌增多,使腸道通透性增加,細菌易位,最終導致肝纖維化。

a-對照組;b-低劑量組;c-中劑量組;d-高劑量組圖3 復合益生菌劑量對小鼠肝臟結構的影響Fig.3 Effects of compound probiotics on liver structure of mice

在生理條件下,營養物質和細菌化合物通過門靜脈循環輸送到肝臟,有助于宿主的體內平衡。因此,腸腔(即微生物、消化食物、異種生物)、門靜脈血和肝臟之間的主要邊界是腸屏障。腸道細菌能夠通過模式識別受體的特殊分子與宿主細胞相互作用。CANI等[13]發現血漿脂多糖水平與小腸細菌過度生長、腸道菌群組成變化和腸道通透性增加有關,代謝性內毒素血癥也會引起肝臟脂肪堆積,但缺乏脂多糖受體復合物CD14/TLR4的小鼠中卻未出現。表明腸道微生物代謝產生的化合物與肝脂肪變性的發生有直接聯系。肝硬化患者的腸道細菌易位增加,血液循環系統中細菌DNA濃度也會相應增加,說明腸道通透性增加反映了機體病原體的感染情況。

2.5 復合益生菌劑量對腎臟組織的影響

由圖4可知,對照組、低劑量組和中劑量組小鼠的腎組織形態正常,而高劑量組小鼠的腎小球有輕微萎縮,可能是源于腸道微生物群的改變,增加了炎癥、尿毒癥和血壓水平[14]。由于哺乳動物不能分解尿素,是利用腸道細菌通過尿素酶將尿素轉化為NH3和CO2,經過肝臟中的尿素循環,一些氨被轉化成尿素,其他則轉化為NH4OH并在糞便中排泄[15]。生活方式、飲食模式改變和纖維攝入減少會導致腸道發育不良,產生過量毒素(如NH3、胺、硫醇、酚類和吲哚)。NH3/NH4OH的形成和腸腔pH值的增加會影響共生菌和病原菌之間的平衡,并導致有害菌增殖[16]。

a-對照組;b-低劑量組;c-中劑量組;d-高劑量組圖4 復合益生菌劑量對小鼠腎臟結構的影響Fig.4 Effects of compound probiotics on kidney structure of mice

腸道中病原菌的過度生長會破壞腸道屏障的完整性,進而增加細菌及其代謝產物向系統循環的易位,導致慢性腎臟病的進展。

2.6 復合益生菌劑量對小鼠腸道菌群結構的影響

圖5結果表明,各組小鼠腸道菌群中的擬桿菌門和厚壁菌門為優勢菌門,但中、低劑量組的乳桿菌科和毛螺菌科均高于對照組,而高劑量組小鼠腸道菌群中的厚壁菌門減少,擬桿菌門和變形菌門增加。BAJAJ等[17]發現肝硬化患者的腸道菌群中變形菌門在肝硬化患者中較高,如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和假單胞菌造成肝硬化的感染,導致死亡[18]；另外,變形菌門中的腸桿菌科、彎曲桿菌科和巴斯德菌科,厚壁菌門中的腸球菌科和鏈球菌科與不良后果有關,而厚壁菌門中法人毛螺菌科可降低不良后果。此外,肝硬化患者腸道也有潛在致病性類群,如最終導致死亡的腸球菌科和鏈球菌科,且腸道的梭狀芽胞桿菌和毛螺菌科也會隨之減少[19]。研究人員發現瘤胃菌科與腎功能負相關,與硫酸吲哚酚代謝物呈正相關,毛螺菌科與腎功能正相關。VAZIRI等[16]發現在腎臟疾病中的放線菌、厚壁菌門中的亞門梭狀芽胞桿菌和變形菌門大量增加。BAJAJ等[17]發現腸道失調與慢性肝病的關系,毛螺菌科與肝病呈負相關,葡萄球菌科、腸球菌科、腸桿菌科與肝病呈正相關。我們的研究結果與其報道相一致,即高劑量組小鼠的腎臟結構出現問題,從科水平上看,高劑量組的毛螺菌科、乳桿菌科較少,幽門螺桿菌、脫硫弧菌科和脫鐵桿菌門增多,可能

a-門水平；b-科水平圖5 復合益生菌劑量對小鼠腸道菌群相對豐度Fig.5 Effect of compound probiotics dosage on relative abundance of intestinal flora in mice

是這些有害菌產生的毒素導致了腎臟組織結構變化。WONG等[20]在腎臟疾病患者腸道菌群中發現了12個科產脲酶,5個科產尿酸酶,4個科產吲哚酶和對甲酚生成酶,都與尿毒癥有關。兩個具有產丁酸酯酶的微生物被削弱,這表明合成短鏈脂肪酸能力下降,患者的炎癥反應可能受損。

2.7 復合益生菌劑量對小鼠腸道菌群功能特征的影響

為更好理解樣本,我們基于16S rRNA的高通量測序數據和同源群數據庫(COG),利用PICRUSt 軟件進一步對小鼠腸道微生物群的功能特征進行了分析。由圖6可見,小鼠腸道微生物主要的COG功能包括：能量生產與轉換、氨基酸轉運與代謝、碳水化合物轉運與代謝、無機離子轉運與代謝、翻譯,核糖體結構和生物起源、轉錄、復制,重組和修復。與對照組相比,復合益生菌添加組的腸道微生物代謝功能更旺盛,但高劑量組的代謝功能豐度呈現降低的趨勢。

圖6 復合益生菌劑量對小鼠微生物功能特征的影響Fig.6 Effect of compound probiotics dosage on microbial function features in mice

由表2可知,添加復合益生菌增強了腸道微生物的代謝功能,如抗壞血酸和醛酸代謝、次生膽汁酸生物合成、甘油酯新陳代謝、碳水化合物代謝、丙酮酸代謝、磷酸戊糖途徑、糖酵解和糖質新生、淀粉和蔗糖的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉化、組氨酸代謝、色氨酸代謝等。其中,組氨酸分解代謝可以產生組胺,組胺能夠抑制抗炎細胞因子TNF-α、IL-1和IL-12的產生,同時防止腸道細菌易位[21]。色氨酸分解代謝產生色胺和吲哚類物質,色胺是一種神經遞質,在調節腸道運動和免疫功能方面發揮作用；另一方面,吲哚是色氨酸的一種主要代謝產物,由擬桿菌和腸桿菌科產生[22],在宿主防御中發揮重要作用。然而,吲哚過量時,在肝臟中,被硫酸化為吲哚酰基硫酸鹽,這是一種與慢性腎病相關的尿毒癥毒素[23]。隨著益生菌劑量的增加,代謝功能降低,且與炎癥相關的脂多糖生物合成、甾類激素生物合成、花生四烯酸代謝代謝通路豐度增加。GILL等[24]也研究發現炎癥相關通路，如脂多糖合成、類固醇合成、生物素代謝等與腸道菌群顯著相關,表2中高劑量組中氮代謝要高于其他組,與腎臟病理學檢查結果一致。高劑量組的維生素B6的新陳代謝、甜菜堿生物合成和N-聚糖生物合成代謝功能增強,表明益生菌含量過高,并沒有完全破壞其他的微生物代謝功能。RAO等[7]認為益生菌不應該被當作營養食品補充劑,飲食正常、身體健康的人群不需要額外補充益生菌；如果飲食不規律,且經常吃不健康的食物,適時適量補充益生菌確實可改善腸道菌群。

表2 微生物功能特征的豐度值Table 2 Abundance value of microbial functional features

3 討論

腸道微生態在維持宿主健康和體內平衡的調節中起著重要作用,越來越多證據表明,微生物群組成和結構的變化可影響人類健康和疾病。腸道菌群影響多種病理生理過程,在正常生理和疾病方面,肝臟和腸道之間存在緊密的相互作用,腸肝軸參與了各種肝臟疾病,從非酒精性脂肪肝疾病,酒精性脂肪性肝炎到肝纖維化以及肝細胞癌。腸肝軸已經成為該領域的研究熱點。SCHNEIDER等[25]探討了腸道菌群失調在急性肝損傷中的作用,Nlrp6小鼠的共生菌群誘導肝臟單核細胞來源的巨噬細胞出現Ly6Chi表型,并加劇急性肝損傷,且該表型可通過糞便菌群轉移至WT小鼠。此外,NatureMedicine期刊發表的一項研究顯示,通過對肝衰竭小鼠模型單細胞轉錄組學進行分析,全方位揭示了腸道菌群在急性肝衰竭中的作用,發現腸道菌群介導了星狀細胞、內皮細胞、Kupffer細胞的myc-依賴性激活過程[26]。TRANAH等[27]指出,患者的腸道菌群失調(多樣性降低、定殖抗性丟失、致病菌擴增)、腸道屏障被破壞,促進致病菌及PAMP(病原相關分子模式)的易位,從而惡化肝臟炎癥。這些研究證實,腸道菌群結構的改變在肝臟損傷和疾病發生發展中起著關鍵作用。本研究通過對組織病理學的觀察、腸道菌群豐度以及微生物群的功能特征的研究,發現導致腸道和臟器不同程度損傷的原因可能是微生物有害代謝產物造成的。

4 結論

本文研究了不同劑量復合益生菌對小鼠生理、生長代謝特性和腸道菌群結構的影響。結果表明,適量的益生菌能夠顯著提高小鼠的體重及飼料利用率,增加腸道有益菌,增強腸道微生物的代謝功能(抗壞血酸和醛酸代謝、次生膽汁酸生物合成、甘油酯新陳代謝、碳水化合物代謝、丙酮酸代謝、磷酸戊糖途徑、糖酵解和糖質新生、淀粉和蔗糖的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉化、組氨酸代謝、色氨酸代謝)。通過組織病理學發現,益生菌使用過量可能會對小鼠的臟器產生負面影響；腸道菌群結構和代謝功能分析表明,過量使用益生菌可能會使小鼠腸道有害菌增加,維生素B6的新陳代謝、甜菜堿生物合成和N-聚糖生物合成的代謝功能增強,且與炎癥相關的脂多糖生物合成、甾類激素生物合成、花生四烯酸代謝代謝通路豐度增加。

綜上所述,益生菌過量使用可能會給健康帶來一定的風險。補充益生菌應根據個體特性及特殊需求量身定制,不要過量補充,并應根據機體狀況選擇適宜種類的益生菌。