沙棘提取物對幽門螺桿菌脲酶活性的抑制

劉欣,常應九,王樹林,2*,高慶超

1(青海大學 農牧學院,青海 西寧,810016) 2(青海大學 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室,青海 西寧,810016) 3(江蘇省食品質量安全重點實驗室(江蘇省農業科學院農產品質量與營養研究所),江蘇 南京,210014)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是彎曲菌科螺桿菌屬的一種微需氧革蘭氏陰性菌,可定植于人體胃部。H.pylori感染在世界范圍內極為常見,世界人口感染率高達50%[1]。H.pylori與胃炎、消化潰瘍以及胃癌的發生密切相關,已被世界衛生組織列為生物致癌因子[2-3]。臨床上幽門螺桿菌感染最主要采用的治療方案是三聯療法,即質子泵抑制劑配合2種抗生素,常用抗生素為阿莫西林和克拉霉素[4]。由于抗生素的長時間濫用,H.pylori的耐藥性逐年升高,三聯療法療效受到嚴重影響,因此,四聯療法應運而生,即在三聯療法基礎上加入鉍劑輔助治療,但療效并未顯著提高,反而出現了多重耐藥的現象[5]。因此,尋找潛在有效治療H.pylori的替代藥物迫在眉睫。

脲酶(urease,EC3.5.1.5)是H.pylori重要的定殖因子與毒力因子[6],可分解尿素產生氨以中和胃酸,在其周圍形成一片“氨云”,使得H.pylori可以在胃部生長繁殖。研究表明,剔除脲酶突變基因,H.pylori不能在無菌豬仔胃部定殖[7]。脲酶能分解尿素產生過量氨,并進一步形成硝酸鹽和亞硝酸鹽損害組織甚至致癌[8]；尿素的水解產物還能激活單核細胞,促使免疫炎癥遞質和超氧自由基的分泌,促使空泡的形成[6,9]。在脲酶的結構單元中,其活性位點的Ni2+和活性位點附近的必需基團巰基對脲酶的催化作用是必需的,而脲酶的活性又與H.pylori能否成功定殖胃部,影響生物體氮利用有關系[4],因此,抑制脲酶活性被視作抗菌物質研究的關鍵[10-11]。

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)為青藏高原的特色漿果資源,屬藥食同源植物,目前已從沙棘根、莖、葉、果實中分離了多種生物活性物質,如甾醇類化合物、多酚類化合物、多糖、不飽和脂肪酸等。沙棘鮮果可直接食用,但因其酸度較大,故主要用于加工,當前市場上的沙棘產品主要包括食品、藥品、化妝品、保健品等8大類,沙棘食品主要為沙棘飲料、沙棘茶、沙棘果醋、沙棘酒和沙棘果粉等。在飼用價值方面,以沙棘葉和沙棘殘渣為飼料或補充飼料可有效提高乳肉產品的質量、數量,增加了優質飼料的種類[12]。在藥用價值方面,沙棘為藏、蒙傳統藥物用于治療燒傷、凍傷、心腦血管疾病等,早期研究表明,沙棘提取物對多種腸道致病菌有抑制作用,沙棘中的抑菌成分多樣,包括沙棘甾醇、沙棘多糖及沙棘黃酮等,且沙棘在調節腸道微生物系統方面也有一定功效[13]。研究發現沙棘籽、葉提取物對白色念珠菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等均有很強的抑菌效果[14-17]。黃國棟等[18]用沙棘原花青素治療H.pylori相關性胃炎,治療組的有效率高達88%。目前,沙棘資源雖得到一定程度的開發,但是關于沙棘抗H.pylori感染的潛在機制鮮有報道,考慮到幽門螺旋桿菌脲酶(Helicobacterpyloriurease,HPU)作為H.pylori定殖于胃部的重要因子,本試驗將研究沙棘提取物對HPU的抑制作用機制,為探明沙棘提取物抑制H.pylori感染機制提供基礎數據,進一步開發沙棘資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生沙棘鮮果,青海省西寧市城北區；幽門螺桿菌ATCC 43504標準株,美國菌種保藏中心。

1.2 試驗儀器與試劑

1.2.1 試驗試劑

LA3540哥倫比亞瓊脂基礎、LA3550布氏肉湯、R0010高效RIPA裂解液(組織/細胞)、BC4110脲酶活性檢測試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；A045-2蛋白定量測試盒,南京建成生物工程研究所；RN08-EASYspin細菌總RNA提取試劑盒,北京艾德萊生物科技有限公司；RR820A熒光定量PCR試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。

1.2.2 試驗儀器

SW-CJ-ID單人凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司；YM50FNG高壓蒸汽滅菌鍋,上海三申醫療器械；SPX-450FT恒溫生化培養箱,寧波普朗特儀器有限公司；Multiskan Sky微量核酸蛋白測定儀,美國Thermo Fisher公司；Centrifuge 5430R低溫高速離心機,德國Eppendorf有限公司；CFX-96 Touch熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司。

1.3 樣品制備及主要指標測定

1.3.1 沙棘水及乙醇提取物的制備

新鮮沙棘果烘干打粉,果粉分別與水、體積分數80%的乙醇以料液比1∶20(g∶mL)混合,超聲輔助提取2次(40 ℃,30 min),提取液經過濾后濃縮至一定體積,將濃縮的提取液進行真空冷凍干燥,所得凍干物按濃度需求以原溶劑進行復溶,并以0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.3.2H.pylori的培養

H.pylori接種于布氏肉湯培養基,添加體積分數5%胎牛血清和混合抗生素(萬古霉素0.01 mg/mL,兩性霉素B 0.01 mg/mL,多粘菌素0.000 2 mg/mL,甲氧芐氨0.005 mg/mL),于微需氧條件下(5% O2,10% CO2和85% N2),37 ℃恒溫振蕩培養24 h,得菌液備用。

1.3.3 脲酶的制備

脲酶提取參照XIAO等[19]的方法并進行改進。肉湯培養物離心(6 000×g,10 min,4 ℃)以收集菌體,以pH 7.4的PBS緩沖液清洗兩遍,加入適量的細胞裂解液、蛋白酶抑制劑,混勻,冰浴20～30 min。再次離心(15 000×g,5 min,4 ℃)收集脲酶,檢測其活性,并置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.4 HPU酶活性測定方法

采用Berthelot法(靛酚藍顯色法)對HPU的酶活性進行測定。按脲酶活性測定試劑盒將尿素溶于蒸餾水,加入脲酶溶液,充分混勻后于37 ℃反應1 h,再加入顯色液進行顯色,于630 nm處檢測吸光值,測得脲酶活性為1.22 U/mg prot,一個脲酶活性單位定義為1 mg蛋白1 min產生1 μg NH3-N(氨氮),計算如公式(1)所示：

(1)

式中：UE,酶活力,U/mg prot；ΔA(測定)=A(測定管)-A(對照管),吸光值之差；ΔA(標準)=A(標準管)-A(空白管),吸光值之差；ρ(標準品),氮標液的質量濃度,μg/mL；V(酶促),酶促反應體系總體積,mL；V(樣本),加入反應體系中樣本體積,mL；ρ(pr),樣本蛋白質質量濃度,mg/mL；t,反應時間,min。蛋白質濃度由考馬斯亮藍法測定。

1.4 主要研究內容及試驗設計

1.4.1 沙棘水提物對菌液脲酶活性的影響

將沙棘水提物同H.pylori菌液混合,設置組間濃度梯度,各組沙棘水提物體系質量濃度分別為0、0.5、1、2.5、5 mg/mL,于37 ℃振蕩培養6 h,評價其HPU活性差異。

1.4.2 脲酶活性抑制試驗

將沙棘果粉水提物、80%乙醇提取物與HPU于37 ℃孵育20 min后測定其酶活性,設置沙棘水提物的體系質量濃度為5 mg/mL,設置pH 3、4的檸檬酸溶液,80%乙醇作為空白對照。試驗重復3次。

參照WU等[20]設置孵育時間梯度、抑制劑濃度梯度試驗探究沙棘提取物對脲酶活性的抑制作用效力。

將沙棘水提物與HPU混合,設置沙棘水提物的體系質量濃度為5 mg/mL,組間孵育時間分別為5、10、20、40 min,測定各組HPU活性。試驗重復3次。

將沙棘水提物與HPU混合,設置各組間沙棘水提物體系質量濃度分別為0、2.5、5、7.5、10 mg/mL,孵育20 min后測定各組HPU活性。試驗重復3次。

1.4.3 HPU脲酶動力學研究試驗

沙棘水提物的系列質量濃度梯度為0、1、2、3 mg/mL,共4個組。每個濃度組8個試管,每組的8個試管中含不同濃度的尿素溶液(0.5、1、2、4、6、10、16、20 mmol/L)。根據分組,分別加入不同濃度的抑制劑和尿素溶液,再加入HPU溶液,混勻,置于37 ℃水浴20 min后分別測定其脲酶活性,試驗重復3次。

根據Lineweaver-Burk plot雙倒數法作圖求得動力學參數Vmax及米氏常數Km,確定沙棘水提物對HPU的抑制作用類型。

1.4.4 沙棘水提物對HPU脲酶抑制位點影響研究

利用兩類保護劑,一類為含巰基化合物二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)；第二類為脲酶無機保護劑硼酸(boric acid,BA)。兩類保護劑分別針對HPU活性位點附近的巰基和活性中心的Ni2+。

采用硫醇化合物進行保護,將HPU分別與10 mmol/L DTT于37 ℃預反應20 min,然后將被保護的每個脲酶樣品與4 mg/mL沙棘水提物反應20 min,測定脲酶活性。試驗重復3次。

采用無機化合物(BA)進行保護,將HPU與5 mmol/L BA于37 ℃預反應20 min,再向反應體系加入4 mg/mL沙棘水提物反應20 min,測定脲酶活性。試驗重復3次。

1.4.5 沙棘水提物對HPU毒力基因的影響

設置沙棘水提物高劑量組(5 mg/mL)、中劑量組(1 mg/mL)、低劑量組(0.2 mg/mL)和空白對照組。

細菌總RNA的提取與檢測：將沙棘水提物與H.pylori菌液共同孵育12 h,離心收集菌體(4 000 r/min,10 min),參照Aidlab細菌總RNA提取試劑盒說明書提取細菌RNA,檢測其純度及濃度,再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性,電泳條件：電壓150 V,時間15 min。凝膠成像儀檢測電泳結果。

反轉錄反應：所提取RNA的A260/A280達到純度要求1.8～2.0后,按TAKARA反轉錄試劑盒說明進行反轉錄實驗。

引物設計：依據H.pylori26695標準株脲酶蛋白α亞基(urease subunit α,Ure-α),脲酶蛋白β亞基(urease subunit β,Ure-β),脲酶輔助蛋白E(urease accessory protein E,Ure-E),脲酶輔助蛋白H(urease accessory protein H,Ure-H)相應基因的CDS區序列,所得序列見表1,委托生工生物工程股份有限公司設計合成引物。

表1 HPU毒力基因引物序列Table 1 Primer sequence of virulence gene of urease of Helicobacter pylori

實時熒光定量PCR：實時熒光定量PCR擴增程序按試劑盒說明進行操作,于Bio-Rad Real-Time PCR儀上擴增。擴增條件：94 ℃預變性30 s,94 ℃變性5 s,72 ℃延伸30 s,40個循環。

以16S為內參,以空白組表達量為參照,計算各組目的基因的相對表達量,用2-ΔΔCt表示,ΔCtxx組=Ctxx組目的基因-Ctxx組內參基因,ΔΔCtxx組=ΔCtxx組-ΔCt空白組,所得值即為各組目的基因mRNA水平的相對表達量。

1.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同濃度沙棘水提物對菌液脲酶活性影響

不同濃度沙棘水提物對菌液脲酶活性影響試驗結果如圖1所示。隨著沙棘水提物濃度的增加,反應體系中的脲酶殘留活性減小,當沙棘水提物的體系質量濃度為5 mg/mL時,菌液的脲酶殘留活性為7.5%,表明沙棘水提物對H.pylori菌液脲酶活性的抑制作用與提取物濃度呈相關性。

圖1 不同濃度沙棘水提物對菌液HPU活性的影響Fig.1 Effect of concentration of H.rhamnoides water extracts on HPU activities in bacterial solution注：與未加入沙棘水提物的空白組比較,*表示P<0.05,差異顯著； **表示P<0.01,差異極顯著(下同)

2.2 沙棘提取物對HPU的抑制作用

沙棘提取物及其他處理對HPU的抑制作用如圖2所示。在排除溶劑、反應體系酸堿度對酶活性的影響后,結果表明沙棘水提物及乙醇提取物對HPU活性具有明顯抑制作用(P<0.01)。5 mg/mL的沙棘水提物和體積分數80%乙醇提取物作用20 min后,HPU活性分別降至9.6%、6.7%。

圖2 沙棘提取物以及溶劑、體系環境對HPU活性影響Fig.2 Effect of H.rhamnoides extracts,solvent and system environment on the activities of HPU

2.3 沙棘水提物的IC50值測定結果

沙棘水提物抑制H.pylori的IC50值測定結果見圖3。

圖3 不同濃度沙棘水提物對HPU活性影響Fig.3 Effect of concentration of H.rhamnoides water extracts on HPU activities

沙棘水提物對HPU的抑制作用與提取物濃度正相關,當提取物質量濃度>5 mg/mL時,HPU殘留活性<5%,抑制效果明顯,其IC50值為(2.73±0.10)mg/mL。

2.4 孵育時間對HPU活性的影響

沙棘水提物與HPU共同孵育時間對HPU活性的影響試驗結果見圖4。隨著孵育時間的延長,HPU活性逐漸減小,5 mg/mL沙棘水提物與HPU溶液孵育5、10、20、40 min后,HPU活性分別降至9.3%、6.3%、5.7%、3.8%,表明沙棘水提物對HPU的抑制效果呈時間依賴性。

圖4 孵育時間對HPU活性影響Fig.4 Effect of incubation time on HPU activities

2.5 HPU活性動力學方程

HPU的Km和Vmax的測定及Lineweaver-Burk曲線如圖5所示。在Lineweaver-Burk圖中,在沙棘水提物存在下,隨著沙棘水提物濃度的升高,Vmax降低,而Km值并無明顯變化。由Lineweaver-Burk圖分析可知,沙棘水提物對HPU的抑制類型為可逆抑制中的非競爭性抑制,Vmax值為(0.42±0.02)mmol/(L·min),Km值為(1.26±0.10)mmol·L-1,試驗結果表明抑制位點位于HPU活性中心以外的其他位點。

圖5 沙棘水提物抑制HPU的L-B雙倒數作圖法Fig.5 Double-reciprocal Lineweaver-Burk plot of HPU inhibition by H.rhamnoides water extract

有研究表明多酚類物質為非底物類似物的脲酶抑制劑,可通過與HPU活性中心外的必需基團相結合最終形成三元復合物,因不能生成產物以使HPU活性受到抑制。沙棘中富含多酚類物質,因此本試驗結果表明沙棘水提物中的抑菌成分之一可能是多酚類物質。此外,余曉丹[6]發現黃芩苷與野黃芩苷對HPU的抑制類型也為非競爭性抑制；PAULO等[21]研究了白藜蘆醇對HPU的抑制作用,酶動力學結果同為非競爭性抑制。

2.6 HPU活性保護劑試驗結果

不同位點保護劑對HPU活性的保護結果,以及保護劑本身對脲酶活性的影響試驗結果見圖6。DTT對HPU活性無明顯影響,BA對脲酶活性有明顯抑制作用(P<0.05)。巰基保護劑DTT并未降低沙棘水提物對HPU活性的抑制作用,而與沙棘水提物有明顯的協同抑制作用(P<0.05)；在金屬離子保護劑BA與沙棘水提物共存時對HPU活性有明顯的抑制作用(P<0.01)。在抑制位點的試驗中,本試驗選擇了針對活性位點的Ni2+以及活性位點附近必需基團巰基的相應保護劑,巰基試劑的作用機理是巰基試劑與脲酶活性位點附近的巰基相互作用,而無機保護劑BA則通過與Ni2+配位作用阻止抑制劑與HPU的活性位點結合。

圖6 硫醇化合物與無機化合物對于被沙棘水提物 抑制HPU活性的影響Fig.6 Effect of thiol-containing compounds and inorganic compounds on the inhibition of HPU activity by H.rhamnoides water extract注：與未加入保護劑和沙棘提取物的空白組HPU活性比較,*表示P<0.05,差異顯著；**表示P<0.01,差異極顯著;與加入沙棘提取物的試驗組比較,#表示P<0.05,差異顯著；##表示P<0.01,差異極顯著

針對巰基所選用的保護劑DTT并未有任何保護HPU活性的作用,這點同以往其他研究不同,余曉丹[6]研究表明DTT可激活被黃芩苷與野黃芩苷滅活的HPU；LU等[22]試驗結果表明兩面針可以較好地抑制HPU,且DTT也能有效緩解其抑制作用；談麗華[23]發現DTT對于被黃連堿滅活的HPU有較好的激活作用,這種作用與黃連堿、HPU和DTT的孵育順序有關。試驗過程中,考慮到沙棘提取物可能使反應體系的pH不利于DTT發揮其作用,故反應于pH 7.5的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid,HEPES)緩沖液中進行。DTT未起到保護作用表明沙棘水提物抑制HPU的位點可能不是巰基基團,這一結果也可能與HPU是粗提液有關。對于活性中心的Ni2+保護劑BA的試驗結果顯示,BA可與沙棘提取物協同抑制HPU的活性,與近些年來同類型研究結果一致。

2.7 沙棘水提物對HPU毒力基因表達的影響

各組HPU毒力基因mRNA的相對表達量見表2。與對照組相比,5 mg/mL沙棘水提物可使ure-α、ure-β、ure-E和ure-H基因表達出現明顯下降(P<0.05)。結果表明,質量濃度為5 mg/mL的沙棘水提物可抑制HPU活性,可能是通過降低脲酶結構基因ure-α和ure-β的表達,抑制脲酶輔酶基因ure-E和ure-H。該結果與連大衛等[9]研究廣藿香醇抑制HPU相關基因表達結果一致。

表2 沙棘水提物對HPU毒力基因mRNA相對表達量的影響Table 2 Effect of H.rhamnoides water extracts on mRNA relative expression level of HPU virulence gene

3 結論

沙棘提取物可明顯抑制HPU活性,是良好的脲酶抑制劑,其抑制類型為非競爭性抑制；抑制位點并非HPU活性中心的Ni2+或活性中心附近的巰基。沙棘提取物抑制脲酶活性可降低脲酶相關基因ure-α、ure-β、ure-E和ure-H的表達。沙棘提取物對H.pylori在胃內感染定植的影響可能與其抑制脲酶活性有一定的關系,其抑菌功效可能是多酚及多糖等物質共同作用的結果,需要進一步研究。