超聲誘導(dǎo)大豆親脂蛋白復(fù)合姜黃素及其特性研究

朱秀清,衣程遠(yuǎn),劉琳琳,曾劍華,王子玥,李美瑩,谷雪蓮,孫冰玉*

1(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省谷物 食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱,150076) 2(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266003)

大豆分離蛋白(soybean isolation protein,SPI)不僅包含β-伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S),還包含與磷脂等脂類結(jié)合的親脂性蛋白,稱為大豆親脂蛋白(soybean lipophilic protein,SLP)。在大豆分離蛋白中,這3種蛋白質(zhì)的含量分別為23%、46%和31%[1]。SLP是一種與磷脂等極性脂緊密結(jié)合的膜蛋白,是由多種蛋白組成的混合蛋白,既含有少量變性的7S、11S,還含有相對(duì)分子質(zhì)量為17、18、31和34 kDa的油體結(jié)合蛋白,油體結(jié)合蛋白主要包括3部分結(jié)構(gòu)：兩性N-末端區(qū)域、中間為反平行β-折疊的疏水區(qū)域以及長(zhǎng)度不固定的兩性C-末端區(qū)域。SLP中磷脂主要成分為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿、甘油磷脂以及少量的溶血磷脂[1]。相比于SPI、7S及11S,SLP可以明顯降低血液中膽固醇的含量,以富含SLP的蛋白組分為食物來(lái)源的糖尿病患者,可以有效抑制其糖尿病腎病綜合癥的發(fā)生[2]。

姜黃素(curcumin,Cur)是一種低相對(duì)分子質(zhì)量的天然多酚化合物,存在于姜黃的根莖中。姜黃素主要用作食品著色劑,其具有廣泛的藥理活性,包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性[3]。但是,姜黃素在水溶液中的溶解度極低,生物利用度差,是限制姜黃素作為保健劑應(yīng)用的主要問(wèn)題。為了提高姜黃素的生物利用度,人們采用了多種方法,通過(guò)包封,生物活性化合物可以免受環(huán)境因素的影響,以可控方式溶解和傳遞。

有研究表明,蛋白質(zhì)能夠作為壁材,用于包埋、傳遞食品功能因子[4-5]。鄧楚君等[6]證明了熱變性乳鐵蛋白與姜黃素的結(jié)合能力較強(qiáng),熱變性能夠提高乳鐵蛋白對(duì)姜黃素的包埋率,為開(kāi)發(fā)基于乳鐵蛋白為載體運(yùn)載疏水性多酚提供了理論依據(jù)。PATE等[7]利用玉米醇溶蛋白制備負(fù)載姜黃素的納米顆粒,以提高姜黃素在水中的分散性及生物活性。姜黃素與蛋白質(zhì)結(jié)合可以極大改善姜黃素的穩(wěn)定性,同時(shí)也與蛋白質(zhì)的類型和性質(zhì)密切相關(guān)。通過(guò)熒光光譜法可知,姜黃素與大豆7S 蛋白以及大豆11S 蛋白的結(jié)合強(qiáng)度均較弱[8]。TAPAL等[9]的研究表明姜黃素分子通過(guò)疏水相互作用在SPI的非極性區(qū)域結(jié)合,而SLP是一種膜蛋白,即是一種高度疏水及親油的蛋白[4],能夠與生物活性物質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物。高強(qiáng)度超聲波處理是食品工業(yè)中新興的一種技術(shù)手段,該技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用于制備納米級(jí)的藥物輸送載體,目前國(guó)內(nèi)外利用超聲技術(shù)對(duì)大豆親脂蛋白包埋姜黃素的研究還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

本研究以SLP為包埋壁材,通過(guò)超聲誘導(dǎo)促進(jìn)SLP和姜黃素的結(jié)合,以包埋率作為監(jiān)測(cè)指標(biāo),考察了超聲輔助條件對(duì)SLP-Cur復(fù)合物包埋效果的影響,并對(duì)復(fù)合物3級(jí)結(jié)構(gòu)、粒徑、電位的變化加以分析。通過(guò)測(cè)定復(fù)合物抗氧化性、姜黃素在腸胃中的釋放率來(lái)評(píng)價(jià)其功能特性,以期為SLP的開(kāi)發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷榨大豆粕,黑龍江鶴旭食品有限公司；姜黃素,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶,酶活力975 U/mg、胰蛋白酶,酶活力200 U/mg,上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；正己烷、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甲醇、冰醋酸、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)、DPPH、乙醇、濃鹽酸、NaOH、PBS、十二烷基硫酸鈉溶液(sodium dodecyl sulfate,SDS)均為分析純。

PHS-3C型pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器有限公司；79-1型磁力攪拌器,江蘇國(guó)華儀器廠；ALPHA 1650型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海譜元儀器有限公司；LAMBDA 365型紫外光譜儀,美國(guó)Perkin Elmer股份有限公司；721E型電子天平,上海恒平科學(xué)儀器有限公司；ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機(jī),德國(guó)CHRIST公司；KH19A型臺(tái)式高速高性能離心機(jī),湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技公司；Nano-ZS-90型電位及粒度分析儀,英國(guó)Malvern公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SLP的制備

參考曾劍華等[10]的方法,取40 g冷榨大豆粕于200 mL正己烷中,46 ℃搖床4 h,4 000 r/min離心5 min,將沉淀物在55 ℃下干燥。將干燥后的脫脂豆粕用0.5 mol/L pH 8.5的Tris-HCl緩沖液于55 ℃水浴提取60 min,再次以4 000 r/min離心15 min,取上清液,將上清液pH值調(diào)至6.4后靜置30 min,然后4 000 r/min離心20 min,取上清液調(diào)pH值至5.2后靜置30 min,將pH值調(diào)回5.5,4 000 r/min離心20 min,分離出沉淀即為SLP；將SLP沉淀用適量去離子水溶解后pH調(diào)至7,冷凍干燥后備用。

1.2.2 SLP基本成分的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法；灰分的測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》；水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》的直接干燥法；脂肪含量測(cè)定參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》的索氏抽提法。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳的測(cè)定

將不同超聲處理?xiàng)l件的SLP樣品配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液,取0.5 mL樣品溶液加入0.5 mL樣品緩沖液(0.2 mL 10% SDS和50 μL 0.01 mol/L的β-巰基乙醇)混勻,沸水浴5 min后上樣,上樣量為20 μL。采用濃縮膠體積分?jǐn)?shù)5%、分離膠體積分?jǐn)?shù)12%,電壓恒定為120 V進(jìn)行凝膠電泳。取出凝膠后放入考馬斯亮藍(lán)染液中染色30 min,再用甲醇、冰醋酸溶液脫色至背景清晰[10]。

1.2.4 姜黃素-乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參考馮芳等[8]的方法,用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇精確配制質(zhì)量濃度為 5、4、3、2、1 μg/mL的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,確定姜黃素最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為426 nm,并測(cè)定不同質(zhì)量濃度姜黃素的吸光值。以姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.181 4X-0.024 6,R2=0.998。

1.2.5 SLP-Cur復(fù)合物的制備及條件優(yōu)化

1.2.5.1 SLP與姜黃素的質(zhì)量比對(duì)SLP-Cur復(fù)合物制備效果的影響

由于SLP的本質(zhì)是脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物,可將SLP溶于緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.4磷酸鹽緩沖液)配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的SLP溶液,將姜黃素溶于乙醇配制成5 mg/mL的姜黃素溶液,分別將姜黃素溶液稀釋成1、2、3、4、5 mg/mL,分別與SLP溶液混合后(體積比為1∶3),SLP與姜黃素的質(zhì)量比分別為30∶1、15∶1、10∶1、7.5∶1、6∶1,室溫下攪拌1 h,避光室溫條件下于磁力攪拌器上攪拌2 h,8 000 r/min離心10 min,取沉淀物用無(wú)水乙醇充分溶解,在9 000 r/min條件下離心10 min去除蛋白質(zhì)聚集體,上清液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在426 nm處測(cè)定吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素的含量[11]。

1.2.5.2 超聲時(shí)間對(duì)SLP-Cur復(fù)合物制備效果的影響

取4 mg/mL的姜黃素溶液加入SLP溶液中(體積比為1∶3),在180 W功率下放入超聲粉碎機(jī)中分別振蕩10、20、30、40、50 min,避光室溫條件下于磁力攪拌器上攪拌2 h,8 000 r/min離心10 min,取沉淀物用無(wú)水乙醇充分溶解,在9 000 r/min條件下離心10 min去除蛋白質(zhì)聚集體,上清液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)426 nm處的吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素的含量。將上清液冷凍干燥后得到SLP-Cur復(fù)合物粉末,并對(duì)不同超聲時(shí)間下制備的復(fù)合物粉末進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定,確定最優(yōu)的超聲處理時(shí)間。

1.2.5.3 超聲功率對(duì)SLP-Cur復(fù)合物制備效果的影響

選擇4 mg/mL姜黃素加入SLP溶液中(體積比為1∶3),分別在120、150、180、210、240 W的功率下進(jìn)行超聲處理20 min。避光室溫條件下于磁力攪拌器上攪拌2 h,8 000 r/min 離心10 min,取沉淀物用無(wú)水乙醇充分溶解,在9 000 r/min條件下離心10 min去除蛋白質(zhì)聚集體,上清液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在426 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素的含量。將上清液冷凍干燥后得到SLP-Cur復(fù)合物粉末,并對(duì)不同超聲功率下制備的復(fù)合物粉末進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定,確定最優(yōu)的超聲處理功率。

1.2.6 包埋率的測(cè)定

包埋率定義為結(jié)合在復(fù)合物中的姜黃素所占總蛋白的百分比[4],按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.7 三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參照LIANG等[12]的方法并略作改動(dòng)。分別將不同條件下制備的SLP-Cur溶液10 mL放入高速離心機(jī)中,在9 000 r/min條件下離心15 min。取離心后的上清液作為樣品,以PBS緩沖液為空白對(duì)照,進(jìn)行紫外光譜掃描,掃描頻率10 nm/s,掃描波長(zhǎng)范圍260～310 nm。所得的一階紫外光譜通過(guò)Origin 2017軟件微分得到二級(jí)衍生紫外光譜。

1.2.8 粒徑與電位的測(cè)定

將10 mL制備好的SLP-Cur溶液放入高速離心機(jī)中,在9 000 r/min條件下離心15 min,取離心后的上清液,采用Nano-ZS-90型電位及激光粒度分析儀測(cè)定其流體動(dòng)力學(xué)粒徑及其分布,用去離子水稀釋樣品,分散相的折射率為1.471,分散劑折射率為1.330,每個(gè)取樣檢測(cè)3次,取平均值。將樣品稀釋1～500倍,用DTS1060C電位皿測(cè)定電位[13]。

1.2.9 抗氧化性測(cè)定

DPPH自由基清除能力是衡量物質(zhì)抗氧化能力的一種有效方法。取2 mL樣品溶液與2 mL 6×10-5mol/L的DPPH溶液充分混勻,避光靜置30 min,于517 nm處測(cè)吸光度A1。同理測(cè)定2 mL樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇充分混勻后的吸光度A2,2 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液充分混勻后的吸光度A0[14-15]。同時(shí)以相同條件下直接水提的SLP-Cur溶液作對(duì)照,DPPH自由基清除率的計(jì)算按照公式(2)進(jìn)行。

空白調(diào)零：2 mL無(wú)水乙醇+2 mL蒸餾水

(2)

1.2.10 體外釋放率的測(cè)定

釋放率的測(cè)定參考TANG等的方法[16-17],稍作修改。為研究釋放曲線,將SLP-Cur復(fù)合物樣品溶于溫度為37 ℃的20 mL PBS(pH 7.4)中,分別加入0.1 mol/mL HCl(pH 1.5)溶液后,在搖床中(37 ℃、100 r/min)混合10 min,加入10 mg胃蛋白酶模擬胃消化60 min,然后用0.4 mol/mL NaOH溶液將反應(yīng)液的pH調(diào)至7.0,加入20 mg胰酶模擬小腸消化60 min。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn),取出2 mL該溶液,并添加回2 mL新鮮緩沖溶液,以保持相同的總?cè)芤后w積。稀釋后,在426 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度At,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式(3)確定姜黃素累積釋放率。

(3)

式中：At,t時(shí)刻樣品的吸光度；b,姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；a,姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；n,溶液稀釋的倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和顯著性分析(least significant difference,LSD,P<0.05),通過(guò)Origin 2017繪圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果除有特殊說(shuō)明外,均為3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLP的特征

2.1.1 SLP的基本成分

表1為SLP的主要成分,在SLP中粗蛋白所占的比例為78.36%,灰分所占比例為5.57%,水分所占比例為2.03%,粗脂肪含量為11.89%,這是因?yàn)镾LP中含有大量磷脂等極性脂,因而脂肪含量較高。

表1 SLP基本成分 單位：%

2.1.2 SLP的相對(duì)分子質(zhì)量

圖1為SLP的凝膠電泳圖,SLP中既含有7S、11S球蛋白,還含有相對(duì)分子質(zhì)量為17、18、31及34 kDa 的油體結(jié)合蛋白。由圖譜可以看出,超聲處理并不會(huì)改變SLP的亞基種類,即超聲處理并不會(huì)改變SLP的一級(jí)結(jié)構(gòu),而是有效保留了SLP的亞基結(jié)構(gòu)。

1-未經(jīng)處理的SLP;2～6-180 W功率下分別超聲處理10、20、30、 40、50 min的SLP;7～10-超聲處理20 min條件下,分別在 120、150、210、240 W功率下超聲處理的SLP圖1 不同超聲條件下SLP凝膠電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of SLP under different ultrasonic treatments

2.2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖2所示,姜黃素在無(wú)水乙醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.181 4X-0.024 6,線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.998,線性關(guān)系較好。

圖2 姜黃素在無(wú)水乙醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of curcumin in absolute ethanol solution

2.3 制備條件對(duì)SLP-Cur復(fù)合物制備效果的影響

2.3.1 SLP與姜黃素的質(zhì)量比對(duì)SLP-Cur復(fù)合物制備效果的影響

如圖3所示,用質(zhì)量濃度10 mg/mL的SLP溶液分別與質(zhì)量濃度1、2、3、4、5 mg/mL的姜黃素乙醇溶液以3∶1的體積比制備復(fù)合物溶液,SLP與姜黃素的質(zhì)量比依次為30∶1、15∶1、10∶1、7.5∶1、6∶1。隨著姜黃素濃度的不斷增加,包埋率逐漸增加,當(dāng)SLP與姜黃素的質(zhì)量比為7.5∶1時(shí),包埋率達(dá)到最大值,之后隨著姜黃素濃度的增加,包埋率有下降的趨勢(shì)。原因可能是隨著姜黃素含量增多,需要更多蛋白質(zhì)來(lái)運(yùn)載姜黃素,當(dāng)SLP與姜黃素質(zhì)量比為7.5∶1時(shí),蛋白質(zhì)所能承載的姜黃素達(dá)到飽和。因此,本實(shí)驗(yàn)選取SLP與姜黃素的質(zhì)量比7.5∶1時(shí)為最優(yōu)水平。

圖3 SLP與姜黃素的質(zhì)量比對(duì)SLP-Cur包埋率的影響Fig.3 Effect of the mass ratio of SLP to curcumin on the encapsulation efficiency of SLP-Cur注：不同字母代表差異顯著,P<0.05(下同)

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)SLP-Cur復(fù)合物制備效果的影響

由圖4可知,隨著超聲時(shí)間的增加,包埋率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在超聲20 min時(shí)包埋率達(dá)到最高值,原因可能是超聲波會(huì)破壞蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵,從而使蛋白質(zhì)分子在一定程度上展開(kāi),暴露出更多的疏水區(qū)域,有利于與姜黃素結(jié)合。超聲處理20 min后,大豆親脂蛋白對(duì)姜黃素的包埋率開(kāi)始下降,SUI等[18]指出在300 W條件下超聲12 min后如果持續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間,則過(guò)量的能量會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白分子內(nèi)的疏水區(qū)域過(guò)多暴露在外界的水環(huán)境中,形成不溶性聚集體,使溶解性降低,而本實(shí)驗(yàn)是在超聲功率為180 W進(jìn)行,因此形成不溶性聚集體的時(shí)間會(huì)有所延長(zhǎng),降低了包埋率。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)SLP-Cur包埋率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time treatments on the encapsulation efficiency of SLP-Cur

圖5為不同超聲時(shí)間誘導(dǎo)下SLP-Cur復(fù)合物溶液紫外吸收光譜圖、粒徑及電位變化圖。由于大豆蛋白側(cè)鏈含有不同的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基,會(huì)產(chǎn)生不同的紫外吸收峰,分析氨基酸殘基的相對(duì)移動(dòng)可以反映出蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象的變化[19]。色氨酸和酪氨酸均在280 nm處出現(xiàn)特征吸收峰,由于譜峰的信號(hào)疊加很難分辨出峰的具體特征,因此對(duì)紫外吸收光譜進(jìn)行求導(dǎo)得到其二階導(dǎo)數(shù)光譜,用于分析近紫外區(qū)域復(fù)雜的蛋白譜圖遷移信息[20]。由圖5-a可知,SLP-Cur復(fù)合物溶液紫外光譜的二階導(dǎo)數(shù)值隨著超聲時(shí)間的增加而增大,超聲處理20 min時(shí)達(dá)到最大值,并且紅移程度最大；繼續(xù)延長(zhǎng)超聲誘導(dǎo)時(shí)間,復(fù)合物的紫外吸收逐漸降低。未超聲時(shí)大豆親脂蛋白中的疏水基團(tuán)埋藏在蛋白分子的內(nèi)部,超聲波的空穴效應(yīng)和微束流效應(yīng)促進(jìn)了疏水基團(tuán)的暴露[21],更有利于姜黃素結(jié)合在蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域,使大豆親脂蛋白對(duì)姜黃素的包埋率達(dá)到最高；之后過(guò)度的能量又會(huì)使蛋白質(zhì)分子重新形成不溶性聚集體,疏水基團(tuán)被包埋,此時(shí),大豆親脂蛋白與姜黃素結(jié)合的疏水位點(diǎn)減少,使包埋率降低。

由圖5-b可知,復(fù)合物溶液粒徑總體呈單峰分布,粒徑集中分布在106～190 nm,說(shuō)明復(fù)合物溶液比較穩(wěn)定。SLP-Cur復(fù)合物經(jīng)過(guò)超聲處理,在前30 min內(nèi),復(fù)合物粒徑逐漸變小,且超聲20 min時(shí)與超聲30 min時(shí)復(fù)合物的粒徑變化不大。CHANDRAPALA等[22]觀察到超聲處理后溶液的平均粒徑降低,這是由于超聲波的空穴效應(yīng)產(chǎn)生了機(jī)械剪切力等物理作用使蛋白顆粒被粉碎,從而使蛋白質(zhì)表面分子發(fā)生解離,粒徑降低。在超聲處理40、50 min時(shí),復(fù)合物的粒徑有變大的趨勢(shì),且峰值變寬,可能是過(guò)度的能量使蛋白形成不溶性聚集體導(dǎo)致粒徑增大,不利于與姜黃素結(jié)合,與包埋率、三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果相吻合。

由圖5-c可知,超聲時(shí)間為20 min時(shí)復(fù)合物Zeta電位絕對(duì)值最高,粒子間的靜電斥力最大,體系趨于穩(wěn)定[23]；隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),復(fù)合物的Zeta電位絕對(duì)值逐漸減小,說(shuō)明此時(shí)體系內(nèi)分子表面靜電荷密度減小,靜電相互作用減弱。原因可能是超聲作用使得SLP疏水基團(tuán)暴露的同時(shí)帶有羧基的氨基酸暴露出來(lái),電位絕對(duì)值增大[24]。在前20 min靜電斥力占主導(dǎo)作用使得蛋白分子分散,之后隨著疏水基團(tuán)的不斷暴露,疏水作用占據(jù)主導(dǎo),包埋了帶有負(fù)電荷的氨基酸并形成新的更大體積的聚集體。綜上,選擇超聲時(shí)間20 min為最優(yōu)水平。

a-二階導(dǎo)數(shù)光譜;b-粒徑;c-電位圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)SLP-Cur的二階導(dǎo)數(shù)光譜、粒徑、電位的影響Fig.5 Second derivative absorbance,particle size distribution and Zeta potential of SLP-Cur under different ultrasonic time

2.3.3 超聲功率對(duì)SLP-Cur復(fù)合物制備效果的影響

由圖6可知,隨著超聲功率的增加,包埋率在功率為210 W時(shí)達(dá)到最大值,之后隨著超聲功率增加而下降。根據(jù)李楊等[25]研究,適當(dāng)?shù)某曁幚頃?huì)使SLP的溶解性及疏水作用有所提高,而繼續(xù)增加超聲功率及超聲時(shí)間,則會(huì)對(duì)SLP的性能產(chǎn)生一定的負(fù)面影響,原因可能是能量過(guò)多使蛋白質(zhì)過(guò)度解折疊,大量疏水殘基暴露于表面,相互作用的機(jī)會(huì)增加,重新形成了不溶性聚集體,導(dǎo)致復(fù)合物包埋效率下降。

圖6 超聲功率對(duì)SLP-Cur包埋率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power treatments on the encapsulation efficiency of SLP-Cur

圖7為不同超聲功率時(shí)SLP-Cur復(fù)合物溶液紫外吸收光譜圖、粒徑及電位變化圖。由圖7-a可知,SLP-Cur復(fù)合物溶液紫外光譜的二階導(dǎo)數(shù)值隨著超聲功率的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在超聲功率為180 W達(dá)到最大值0.001 6,這是因?yàn)槌暪β实脑龃蟠偈股彼帷⒗野彼岬劝被釟埢┞?紫外吸收增大,表征色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的275 nm波長(zhǎng)處的吸收峰發(fā)生了明顯的紅移,向280 nm處移動(dòng),表征酪氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的296 nm波長(zhǎng)處的吸收峰發(fā)生了一定程度的紅移,并伴隨著紫外吸收強(qiáng)度的增強(qiáng),蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變,氨基酸殘基向疏水強(qiáng)的環(huán)境移動(dòng)[20]。紫外吸收強(qiáng)度增高,表明SLP的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的展開(kāi),芳香族氨基酸殘基暴露于蛋白質(zhì)表面。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,可能是SLP與姜黃素的相互作用改變了蛋白質(zhì)微環(huán)境,姜黃素從極性環(huán)境向弱極性環(huán)境遷移。超聲功率180 W時(shí),復(fù)合物的紫外光譜紅移程度最大,峰值最高,此時(shí)最有利于SLP與姜黃素結(jié)合,容易得到包埋率最優(yōu)效果。但是繼續(xù)增大超聲功率后,紫外吸收逐漸降低,這是因?yàn)檫^(guò)度的能量使蛋白質(zhì)分子發(fā)生物理聚集,讓原本展開(kāi)的蛋白結(jié)構(gòu)重新聚合,氨基酸殘基被重新包埋,因而紫外吸收降低,而在蛋白分子聚集的過(guò)程中,部分姜黃素與蛋白發(fā)生物理吸附使包埋率在210 W時(shí)有所提高。

由圖7-b可知,復(fù)合物粒徑總體呈單峰分布,說(shuō)明體系較為穩(wěn)定。在超聲功率增加到180 W之前,復(fù)合物粒徑逐漸變小,繼續(xù)增加超聲功率后復(fù)合物粒徑開(kāi)始變大。可能是因?yàn)樵谳^高功率條件下處理的蛋白發(fā)生相互作用增加了分子間的碰撞與聚集,從而表現(xiàn)出粒徑輕微的增加,這與DESRUMAUX等[26]提出的“過(guò)度加工”概念相符,乳液粒徑在中等功率時(shí)達(dá)到小尺寸,在高功率下粒徑又會(huì)增大。結(jié)合包埋率發(fā)現(xiàn),在180 W功率下,蛋白分子的解離與聚合同時(shí)進(jìn)行,且聚合處于主導(dǎo)地位,因而在210 W條件下通過(guò)分子的聚集吸附了部分姜黃素分子,雖然包埋率有所提高,但并不穩(wěn)定。

由圖7-c可知,與超聲120 W相比,超聲150、180 W時(shí)溶液的Zeta電位絕對(duì)值有所提高,這是因?yàn)镾LP的帶電基團(tuán)在超聲波的作用下暴露于分子表面,Zeta電位絕對(duì)值增大。之后增加超聲功率對(duì)溶液電位絕對(duì)值影響并不明顯,電位絕對(duì)平均值在(24.7±0.23)mV左右。超聲使蛋白質(zhì)分子鏈展開(kāi)的同時(shí),部分蛋白質(zhì)分子在超聲波產(chǎn)生的空泡內(nèi)爆、微射流和湍流作用下發(fā)生聚集,使帶電荷氨基酸掩埋于分子內(nèi)部[23],因此電位絕對(duì)平均值變化并不明顯。但與150 W功率下復(fù)合物溶液的粒徑相比,在180 W功率下復(fù)合物溶液粒徑最小,體系更加穩(wěn)定。綜上,本實(shí)驗(yàn)選擇180 W為最優(yōu)水平。

a-二階導(dǎo)數(shù)光譜;b-粒徑;c-電位圖7 不同超聲功率對(duì)SLP-Cur的二階導(dǎo)數(shù)光譜、粒徑、電位的影響Fig.7 Second derivative absorbance,particle size distribution and Zeta potential of SLP-Cur under different ultrasonic power

2.4 SLP-Cur復(fù)合物的抗氧化能力

DPPH自由基清除能力是衡量物質(zhì)抗氧化性的一種有效方法[27]。與未超聲處理的復(fù)合物相比,超聲處理提高了復(fù)合物的DPPH自由基清除能力(圖8)。未超聲復(fù)合物與超聲后復(fù)合物的包埋率分別為(16.13±0.66)%、(19.63±0.06)%,DPPH自由基清除率分別為(52.6±0.64)%、(59.3±0.66)%,說(shuō)明超聲提高了復(fù)合物的DPPH自由基清除能力,原因可能是超聲促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的打開(kāi),氨基酸基團(tuán)與自由基更易接觸。經(jīng)過(guò)模擬體外胃消化與腸消化后,胃蛋白酶消化物跟胰蛋白酶消化物的DPPH自由基清除能力降低,原因是與姜黃素結(jié)合的SLP肽鏈逐漸水解,釋放出姜黃素。由于姜黃素本身的DPPH自由基清除率低于消化物的DPPH自由基清除率,可以肯定消化物的DPPH自由基清除能力來(lái)自SLP。并且超聲后不同階段的消化產(chǎn)物DPPH自由基清除率有所下降,說(shuō)明超聲在不影響蛋白質(zhì)可消化性的前提下提高了復(fù)合物的抗氧化性。

圖8 SLP-Cur的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH free radical clearance of SLP-Cur注：不同字母表示差異顯著,P<0.05,不同數(shù)字代表不同組別(下同)

2.5 SLP-Cur復(fù)合物的體外釋放率

在消化過(guò)程中,pH和離子強(qiáng)度、蛋白酶酶解、其他表面活性劑等因素可能會(huì)導(dǎo)致SLP-Cur復(fù)合物發(fā)生巨大的變化。而SLP作為一種蛋白質(zhì),極容易被消化液中的胃蛋白酶、胰蛋白酶等酶解,因而可能會(huì)影響其對(duì)姜黃素的輸送特性以及在消化液中的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬體外消化,研究了經(jīng)過(guò)超聲誘導(dǎo)與未超聲復(fù)合物在模擬胃液中的姜黃素的釋放率。如圖9可知,經(jīng)過(guò)超聲處理與未經(jīng)超聲處理的SLP-Cur復(fù)合物在消化0.5 h時(shí)姜黃素釋放量分別達(dá)到(43±2.8)%、(62±3.5)%,說(shuō)明SLP在模擬胃消化條件下被迅速降解,釋放出姜黃素,這與本研究中測(cè)定的復(fù)合物DPPH自由基清除率結(jié)果相符。SLP對(duì)姜黃素具有一定的保護(hù)作用,但在0.5～1 h的消化階段,姜黃素被迅速釋放出來(lái),這時(shí)SLP被降解使姜黃素的釋放速度加快。在整個(gè)胃消化階段,超聲處理后的復(fù)合物相比于未超聲處理復(fù)合物姜黃素釋放率減少4%,這可能是由于超聲處理促進(jìn)二者結(jié)合的緣故。

圖9 消化時(shí)間對(duì)姜黃素釋放率的影響Fig.9 Curcumin release rate changes during digestion

3 結(jié)論

本文采用超聲技術(shù),探究制備SLP-Cur復(fù)合物的最佳條件以及超聲對(duì)復(fù)合物功能性質(zhì)的影響,結(jié)果表明,在SLP與姜黃素的質(zhì)量比為7.5∶1、超聲時(shí)間20 min、超聲功率180 W條件下,大豆親脂蛋白對(duì)姜黃素的包埋效果最好,包埋率高達(dá)(19.63±0.06)%。SLP-Cur復(fù)合物電位絕對(duì)值較大,復(fù)合物體系較為穩(wěn)定。紫外光譜、激光粒徑掃描結(jié)果表明,超聲處理使SLP中氨基酸殘基向疏水強(qiáng)的環(huán)境移動(dòng),芳香族氨基酸殘基暴露于蛋白質(zhì)表面,增強(qiáng)了SLP的疏水性,有利于與姜黃素的結(jié)合,有效提高了SLP對(duì)姜黃素的包埋率。此外,通過(guò)抗氧化活性的測(cè)定及體外消化模擬實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,超聲誘導(dǎo)可以有效提高復(fù)合物的抗氧化能力,更好地保護(hù)姜黃素,減少了姜黃素在胃中的釋放率。綜上所述,超聲誘導(dǎo)對(duì)于大豆親脂蛋白與姜黃素的復(fù)合產(chǎn)生了積極影響,有望為大豆親脂蛋白與多酚類生物活性物質(zhì)相互作用的研究提供參考依據(jù)。