單寧酸和蘆丁對馬哈魚魚皮明膠凝膠性質的影響

金文剛,尚美君,劉洋,潘錦鋒*

1(陜西理工大學 生物科學與工程學院,陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中,723001) 2(大連工業大學 食品學院,國家海洋食品工程技術研究中心,遼寧 大連,116034)

明膠是食品工業中重要的添加劑,其凝膠具有熱可逆性的獨特優勢,同時具有良好的乳化性和起泡性,廣泛應用于各類食品的生產。食用明膠通常源自豬、牛、禽等動物,但瘋牛病等疫病的蔓延使消費者對這些明膠的安全性產生質疑,同時宗教文化如穆斯林、印度教、猶太教規定也使得哺乳動物明膠的應用受到限制[1-2]。與之相反,魚類明膠安全性高,應用不受宗教文化限制,我國擁有大量的魚類膠原資源,魚皮明膠的開發具有巨大的潛力。然而,魚皮明膠的脯氨酸和羥脯氨酸含量顯著低于哺乳動物明膠,導致其凝膠強度、成膠融膠溫度較低,制約了魚皮明膠在食品中的應用[3]。馬哈魚是冷水性魚類,前期研究顯示馬哈魚魚皮明膠中羥脯氨酸比例較低,凝膠性能較差[4-5],馬哈魚魚皮明膠的食品化應用急需有效提升其凝膠性能的技術。

近年來,多酚類物質以安全性高、有益于健康、接受度高的特點成為食品添加劑的發展方向。酚類化合物富含酚羥基,可與蛋白質分子形成共價或非共價作用,促使蛋白質發生交聯[6-7],同時還可能氧化形成醌類物質并進一步與蛋白質形成醌類蛋白質加和物,提高蛋白質的凝膠性能[8]。有學者發現椰子殼和腰果樹皮的粗多酚提取物可提升魚皮明膠的凝膠強度[9-13]。CAO等[14]發現阿魏酸和單寧酸可通過與明膠交聯改善凝膠的機械性能。尚美君[5]發現適量單寧和蘆丁以及氧化單寧、氧化蘆丁可提升河豚魚皮明膠凝膠性能。然而基于酚類物質提升魚類明膠凝膠性能的報道仍相對較少,效應與機制有待進一步研究。為此,本文以馬哈魚魚皮明膠為原料,考察單寧酸、蘆丁及二者的氧化態對馬哈魚明膠凝膠特性的影響,包括凝膠強度、色差、微觀結構、二級結構和蛋白形式,旨在為改善其明膠凝膠性能,拓展應用空間提供方法。

1 材料與方法

1.1 原料與設備

原材料：馬哈魚魚皮,遼寧遠洋漁業公司提供(魚皮解凍,剔盡魚肉,冰水沖洗,剪成0.5 cm×0.5 cm小塊,封于自封袋中,-20 ℃儲存備用)。單寧酸、蘆丁(分析純),上海生工生物工程公司。

儀器設備：TA質構儀,英國SMS公司；UltraScan色差儀,美國HunterLab公司；ATTO垂直電泳系統,日本ATTO公司；Nicolet iS20紅外光譜儀,美國賽默飛公司；低場核磁分析儀,蘇州紐邁公司；JSM-7800F掃描電鏡,日本電子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚溶液和魚皮明膠膠凍的制備

多酚溶液制備方法參照TENDEE等[10]。稱取2份相同質量的單寧酸(tannin acid,T)或蘆丁(rutin,R),分別溶于60 ℃水中,并調節pH至8,即得多酚溶液；另一份多酚溶液中由氮吹儀控制通入流速0.5 L/min的O2[5],于40 ℃氧化1 h,即得氧化多酚溶液(oxidized tannin acid,OT和oxidized rutin,OR)。

馬哈魚皮明膠提取參照劉洋等[4]的方法,采用0.05 mol/L NaOH溶液堿洗,0.1 mol/L H3PO4溶脹,用熱水法于40 ℃提取,明膠溶液紗布過濾后,凍干制備魚皮明膠。稱取一定量明膠凍干粉溶于36 ℃水中,加入一定量多酚或氧化多酚溶液,使其為明膠質量的2%、4%、6%、8%(質量分數),調總體積至明膠質量分數6.67%,然后分別移入小燒杯中,于4 ℃冷卻24 h,獲得明膠膠凍。

1.2.2 明膠膠凍凝膠強度測定

明膠膠凍的凝膠強度參照課題組前期方法[4-5],通過質構儀獲取。質構儀操作參數為：P/5探頭,測前速度1.00 mm/s,測試速度0.5 mm/s,測后速度10 mm/s,穿透4 mm,測試距離15 mm。

1.2.3 明膠膠凍色差測定

明膠膠凍的色差由測色儀測定。儀器校準后,采用L*值(亮度)、a*值(紅-綠)和b*(黃-藍)值表示[4-5]。

1.2.4 明膠膠凍水分分布測定

魚皮明膠膠凍的水分分布參照DONG等[11]方法測定。將膠凍樣品置于一個直徑25 mm的圓柱形玻璃管,插入到環境溫度為4 ℃的核磁共振探頭中,收集脈沖序列(carr-purcell-meiboom-gill,CPMG)衰變信號,分析自旋弛豫時間(T2)[5]。掃描次數：4次,回聲數據：5 000次,反演得到橫向弛豫時間。

1.2.5 魚皮明膠膠凍的微觀結構觀察

將明膠膠凍于冰溫案板上切割成1 mm厚的小薄片,迅速固定于涂有導電膠的冷場電鏡樣品臺中,并采用液氮雪泥立即冰凍,傳輸至冷場樣品制備腔中冷臺后進行淬斷,并于-60 ℃升華15 min,最后傳輸進掃描電鏡進行微觀結構觀察并拍照。

1.2.6 明膠膠凍蛋白條帶分析

參考LAEMMLI等[12]的方法,采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)法對明膠膠凍蛋白條帶進行分析。將膠凍放置室溫下緩化1 h,混勻后稀釋10倍,85 ℃水浴加熱1 h,離心(3 500×g)5 min,上清液與上樣緩沖溶液(0.5 mol/L Tris-HCl-2% SDS-25%甘油,pH 6.8)以體積比1∶1混合,沸水浴4 min。電泳儀條件為：濃縮膠5%,分離膠10%,上樣量10 μL,濃縮膠和分離膠電流分別為15和30 mA[5]。經考馬斯亮藍R-250染色,脫色后凝膠成像儀拍照觀察蛋白條帶。

1.2.7 魚皮明膠膠凍二級結構分析

采用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)儀分析魚皮明膠膠凍結構。將凍干膠凍樣品與溴化鉀制成薄片,再由夾具放入FTIR紅外光譜儀中進行測量。在400～4000 cm-1掃描,掃描次數為32次,分辨率為4 cm-1,室內溫度為25 ℃[5]。

1.3 數據統計

試驗數據通過SPSS 16.0軟件分析,以平均值±標準偏差表示。采用單因素方差法以及Duncan法進行多重比較差異分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 魚皮明膠膠凍的凝膠強度

圖1-a中,與對照組相比,單寧酸添加組膠凍的凝膠強度顯著改善,并在2%～6%的區間呈現劑量效應,添加質量分數為8%凝膠強度不再增加,與6%添加組持平,接近200 g。氧化單寧酸添加組凝膠強度也顯著增加,但不存在劑量效應,添加量為4%時最高,為198 g。單寧酸與氧化單寧酸組凝膠強度差異不大,僅T-6、OT-6與T-8和OT-8組輕微差異。以上結果表明,單寧酸能夠顯著提升馬哈魚魚皮明膠的凝膠強度,最大增幅接近85%,這與不少多酚與魚明膠互作的研究結果相一致[8,13]。單寧酸含有大量的酚羥基,可能與明膠蛋白相互作用形成氫鍵,故能提高明膠的凝膠性能。也有研究發現多酚氧化后形成的醌類物質可與蛋白分子的巰基、氨基等基團發生反應[5],形成加和物也可促進蛋白質的凝膠性能[7,14]。本研究發現單寧酸與氧化單寧酸的作用效果區別不大,表明單寧酸對馬哈魚魚皮明膠凝膠強度的提升主要源于蛋白分子與單寧酸較弱的非共價作用,可能主要是氫鍵鍵合效應。AEWSIRI等[13]也發現,單寧酸與烏賊明膠的非共價交聯作用比氧化單寧酸與烏賊明膠的共價作用更強烈,對于明膠的界面特性影響更大。

a-2%～8%單寧酸和氧化單寧酸；b-2%～8%蘆丁和氧化蘆丁 CO-對照；T-單寧酸；OT-氧化單寧酸；R-蘆??；OR-氧化蘆丁；2%～8%單寧酸和氧化單寧酸分別標記為T-2、T-4、T-6、T-8、OT-2、OT-4、OT-6和OT-8(a)；2%～8%蘆丁和氧化蘆丁分別標記為R-2、R-4、R-6、R-8、 OR-2、OR-4、OR-6和OR-8(b)圖1 單寧酸、氧化單寧酸和蘆丁、氧化蘆丁對馬哈魚 魚皮明膠膠凍凝膠強度的影響Fig.1 Gel strength of gelatin from chum salmon skin with oxidized and non-oxidized tannin acid and rutin注:不同小寫字母表示具有顯著差異(P<0.05)(下同)

圖1-b顯示,與對照組相比,添加質量分數2%蘆丁后魚皮明膠凝膠強度無明顯變化,當添加4%和8%蘆丁后,魚皮明膠凝膠強度有所增加(P<0.05)；添加低劑量氧化蘆丁(2%～6%)對于魚皮明膠凝膠強度影響不大(P>0.05),而當加入8%氧化蘆丁后魚皮明膠凝膠強度顯著增加(P<0.05)。與氧化蘆丁相比,蘆丁對于馬哈魚魚皮明膠凝膠強度改善效應相對較好。本研究中蘆丁或者氧化蘆丁添加質量分數至8%時馬哈魚魚皮明膠凝膠強度均能提升>70%,尤其是OR-8組,這與YAN等[15]的結果一致。同時,各濃度的蘆丁與氧化蘆丁結果相近,只有OR-8凝膠強度略高于R-8。以上結果表明低濃度的蘆丁對馬哈魚魚皮明膠的凝膠特性作用不大,高濃度的則可顯著提升凝膠強度,氧化與否對于蘆丁的凝膠增強效應影響不大,這也表明蘆丁對魚皮明膠的作用主要是較弱的非共價形式。與單寧酸相比,相同濃度的蘆丁對魚皮明膠的凝膠增強效果較弱,可能由于蘆丁的酚羥基個數相對單寧較少,產生的蛋白與多酚氫鍵作用相對較弱,故單寧的凝膠改善效果更顯著。

2.2 魚皮明膠膠凍的顏色特征

表1展示了單寧酸、氧化單寧酸和蘆丁、氧化蘆丁對馬哈魚魚皮明膠膠凍顏色性質的影響。與對照組相比,添加單寧酸或氧化單寧酸后膠凍L*值降低,a*和b*值有輕微升高,尤其T-8最顯著。L*值隨添加劑量升高而降低,a*和b*值隨添加劑量升高而升高。以上結果表明,單寧酸的添加輕微降低了明膠膠凍的亮度,并略微加深了紅色和黃色。單寧酸在偏堿性條件下可部分氧化轉變成醌,此過程伴隨顏色的加深。由于本實驗中并非真空環境,可能單寧有部分氧化轉變成醌,導致a*上升,即輕微變紅,圖2的凝膠顏色圖片證實了該結果。同時,T組與OT組顏色差異不大,可能在pH 8時單寧酸的氧化進程不強烈,對顏色干涉作用不顯著。

表1 添加單寧酸、蘆丁及其氧化態后馬哈魚魚皮明膠的色差Table 1 Colour differences of chum salmon skin gelatin after addition with tannin acid,rutin and their oxidized products

與對照相比,加入蘆丁后明膠膠凍L*值稍有下降,而a*、b*值呈現增加,趨勢不太顯著。然而,氧化蘆丁組L*值顯著低于對照組,a*、b*值高于對照組。以上結果表明蘆丁輕微增加了膠凍的顏色,但氧化蘆丁則顯著降低了馬哈魚魚皮明膠膠凍的亮度,大幅度增加了膠凍的紅色與黃色。圖2直觀地展示了蘆丁、氧化蘆丁添加組的顏色差異,與各值相對應?？赡苡捎趐H 8時蘆丁易氧化,形成大量醌類物質,呈深棕色。類似的多酚引起的蛋白凝膠顏色加深現象在TEMDEE等[10]和KAEWDANG等[9]的研究中也有報道,但影響程度有所差異,這與多酚的性質和膠凍母體蛋白性質有關。以上結果表明,添加單寧酸對明膠膠凍色差影響不大,而加入氧化蘆丁對膠凍黃度和紅度影響較大。

圖2 添加單寧酸、蘆丁及其氧化態后馬哈魚 魚皮明膠外觀顏色圖Fig.2 Appearance photos of chum salmon skin gelatin after addition with tannin acid,rutin and their oxidized products

2.3 魚皮明膠凝膠水分分布

采用低場核磁分析了馬哈魚魚皮膠凍在單寧酸、氧化單寧酸和蘆丁、氧化蘆丁作用下的水分分布。如圖3所示,膠凍顯示多個T2弛豫時間峰,但主峰T22均處在100～1 000 ms。T2弛豫圖譜表示母體中質子的分布,由于樣品中不存在脂肪,故本研究中主要代表明膠膠凍的水分分布,主峰T22則代表膠凍網絡結構中的可移動水。與對照組相比,添加單寧或氧化單寧的明膠膠凍增加T22弛豫主峰由464 ms向更短弛豫時間遷移,尤其T-8左移到403 ms,OT-4則為351 ms。同時,添加蘆丁和氧化蘆丁的各組T22弛豫主峰由最初的613 ms向更短弛豫時間遷移,其中T-8變為533 ms,OT-8縮短為464 ms。一般來說,較短的弛豫時間意味著水的流動性差,水分與母體物料結合較緊密,而較長的弛豫時間表明水的流動性強,水分與母體物料結合較弱[16-17]。以上結果表明,在單寧酸、氧化單寧酸和蘆丁、氧化蘆丁的作用下,馬哈魚明膠中的水分更為穩定,這與單寧酸、蘆丁及二者氧化態添加后的凝膠強度增強相一致,側面反映了凝膠性能的改善。

a-單寧酸；b-氧化單寧酸；c-蘆??；d-氧化蘆丁圖3 添加單寧酸、蘆丁及其氧化態后馬哈魚魚皮明膠水分分布(T2弛豫時間譜圖)Fig.3 Water status (T2 relaxation time spectra) of chum salmon skin gelatin after addition with tannin acid,rutin and their oxidized products

2.4 魚皮明膠凝膠微觀結構

為了直觀解析膠凍的凝膠性能改變,采用掃描電鏡分析了幾組代表性樣品——添加4%和8%的單寧酸、蘆丁及其氧化態后的馬哈魚魚皮膠凍的顯微結構(圖4)。所有膠凍樣品顯示出典型的海綿狀多孔、網狀結構,對照組膠凍的網狀結構孔隙較大,R-4和OR-4組與其微觀結構類似,孔洞較大,但R-8和OR-8組膠凍孔洞顯著變小,尤其OR-8組,微觀結構非常致密。與此同時,T-4、T-8和OT-8膠凍孔洞與對照組相比略微變小,OT-4組則明顯變小,孔洞較致密。膠凍微觀結構與各自對應的膠凍凝膠強度一致,尤其是OR-8和OT-4,致密微觀結構與二者較高的凝膠強度相吻合。類似結果在KAEWDANG等[9]椰子殼提取物和LEE等[18]單寧酸促明膠改善的研究中都有觀察到。明膠的凝膠強度直接取決于明膠膠凍的微觀結構,后者又主要取決明膠基質中蛋白質分子的排列和締合程度[19]。研究結果表明,單寧酸、氧化單寧酸和蘆丁、氧化蘆丁可能改變魚皮明膠的交聯效率,改善三維網絡結構,增強凝膠性能,單寧酸作用效果總體略優于蘆丁。

圖4 添加單寧酸、蘆丁及其氧化態后馬哈魚魚皮明膠 掃描電鏡圖(放大倍數2 000×)Fig.4 SEM micrographs of chum salmon skin gelatin after addition with tannin acid,rutin and their oxidized products (magnification 2 000×)

2.5 魚皮明膠凝膠蛋白形式

多酚類物質改善蛋白質的凝膠性能存在著多種途徑,一般認為多酚可與肌原纖維蛋白[20]、膠原蛋白[21]等通過共價與非共價方式形成交聯[22]。具體何種作用方式占主導取決于蛋白所處的多酚環境。為了探究單寧、蘆丁對馬哈魚魚皮明膠凝膠特性的作用機制,分析了添加單寧酸、氧化單寧酸和蘆丁、氧化蘆丁的魚皮明膠膠凍的蛋白形式,結果如圖5所示。所有的膠凍樣品都有3條較清晰的α1、α2和β鏈,并且在頂端都有一定量的聚合物產生。圖5明膠蛋白條帶并未因其單寧酸、蘆丁及其氧化態介入而有較大變化,主體條帶灰度和蛋白條帶數量都較穩定,這表明膠凍并未發生蛋白質間的共價交聯或降解,凝膠強度提升不是因為共價鍵蛋白分子聚集造成,而是明膠蛋白分子間氫鍵,疏水作用或靜電作用等引起[5]。本文結果與KAEWDANG等[9],LEE等[18]和YASIN等[23]的研究結果不同,但與ANVARI等[24]的結論相似。根據電泳與凝膠強度結果推斷,低濃度單寧酸因羥基增多可能增加與蛋白質間的氫鍵鍵合,促進凝膠改善,但高濃度單寧酸尤其氧化單寧酸可能因其結構過大,破壞了穩定凝膠的靜電作用,使得明膠蛋白共價交合區域的形成受到抑制,反而未能增加單寧酸或氧化單寧酸的蛋白共價交聯效應,促凝膠作用與低濃度相差不大。蘆丁酚羥基少于單寧酸,因此促氫鍵鍵合作用一般,低濃度下凝膠增強效果不顯著。高濃度的蘆丁和氧化蘆丁則可能增加了氫鍵鍵合作用,并未破壞明膠分子間靜電作用,因此凝膠強度顯著增加。

圖5 添加單寧酸、蘆丁及其氧化態后馬哈魚魚皮明膠SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE spectrum of of chum salmon skin gelatin after addition with tannin acid,rutin and their oxidized products

2.6 魚皮明膠凝膠蛋白二級結構

a-氧化蘆丁、蘆?。籦-氧化單寧酸、單寧酸圖6 添加單寧酸、蘆丁及其氧化態后馬哈魚魚皮明膠 傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectrum of of chum salmon skin gelatin after addition with tannin acid, rutin and their oxidized products

酰胺-A帶反應N—H的伸縮振動,其吸收峰位置與氫鍵締合程度及三螺旋結構有序性密切相關[26-27]。酰胺-B帶反映的是肽鏈中CH2與NH3基團間的相互作用[27-28],本研究中基本所有的明膠樣品都位于2 936～2 941 cm-1,區別不大。

3 結論

通過向馬哈魚皮明膠中添加2種多酚(單寧酸、蘆丁)及其氧化態,結果表明：(1)單寧酸和氧化單寧酸(2%～8%)可與馬哈魚魚皮明膠蛋白形成更多氫鍵,促進有序凝膠網絡結構的形成,并改善凝膠強度,二者作用無顯著區別；(2)蘆丁對馬哈魚魚皮明膠凝膠強度改善作用不顯著,只有高劑量8%蘆丁和氧化蘆丁能顯著增強馬哈魚魚皮明膠凝膠強度,作用方式主要也是氫鍵鍵合；(3)單寧酸、氧化單寧酸和蘆丁對魚皮明膠的顏色性質影響不大,但氧化蘆丁顯著降低了明膠膠凍亮度值,增強了紅度與黃度值。單寧酸和蘆丁合理使用可以增強馬哈魚魚皮明膠的凝膠強度。