香菇柄多糖乙酰化修飾及其抗氧化活性

李順峰,許方方,崔國梅,田廣瑞,高帥平,劉麗娜,王安建,魏書信

(河南省農業科學院 農副產品加工研究中心,河南 鄭州,450002)

香菇(Lentinusedodes)是中國栽培面積和產量最大的食用菌[1]。香菇不僅富含營養物質,還含有大量多糖、酚酸類以及活性蛋白等生物大分子而具有藥用保健功效[2]。香菇柄是香菇商品化處理中的副產物,約占香菇總重的20%～30%[3-4],由于其呈纖維化,適口性差,大部分被廢棄,造成了極大的資源浪費。香菇柄同菌蓋一樣由菌絲組成,同樣含有豐富的碳水化合物、蛋白質、氨基酸等[5]。

多糖具有提高免疫力、抗病毒等多種生物活性,其活性的發揮與結構、化學基團等密切相關,而將某些化學基團引入到多糖大分子鏈中,不僅可改變多糖的理化性質、增強生物活性,而且還可以產生新的活性,如乙酰化青錢柳多糖可激活樹突細胞,提高抗突變能力[6]；硫酸化修飾枸杞多糖可顯著促進免疫淋巴細胞增殖,提高免疫力[7]等。目前,常用的多糖化學修飾方法有乙酰化、硫酸酯化、羧甲基化等[8-12]。多糖經過乙酰化修飾后生物活性顯著提高[8,13-14]。TANG等[15]研究發現羊肚菌多糖經乙酰化修飾后的抗氧化活性以及對肝癌細胞和結腸癌細胞的抑制活性高于其硫酸化修飾多糖和羧甲基化修飾多糖。本文以香菇柄為原料,經水提醇沉等工藝制得香菇柄多糖,對其進行乙酰化(乙酸酐法)修飾,通過控制修飾試劑的比例(使用量)分別制備3種乙酰化多糖,考察了修飾試劑的比例(使用量)對化學修飾香菇柄多糖取代度、多糖和蛋白質含量的影響,并用紫外光譜、紅外光譜和剛果紅試劑對乙酰化修飾前后香菇柄多糖進行初步結構分析,最后對乙酰化修飾前后多糖的抗氧化活性進行評價,為香菇柄多糖抗氧化活性的構效關系研究和香菇柄資源開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇柄購自鄭州信基調味品市場,經50 ℃烘干至含水率低于8%后,粉碎過40目篩后備用。

重蒸酚、DPPH、葡萄糖、無水乙醇、三氯化鐵、硫酸亞鐵、甲醇、氫氧化鈉等均為國產分析純。

FA2004C型分析天平,上海越平科學儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司；RV8V-C型旋轉蒸發儀,德國IKA 集團；LD-Y300A型高速萬能粉碎機,上海頂帥電器有限公司；DF-10型恒溫磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限公司；H2050R型臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香菇柄多糖的制備及多糖和蛋白質含量的測定

1.2.1.1 香菇柄多糖的制備

將香菇柄粉與蒸餾水按照料液比1∶15(g∶mL)混勻,沸水浸提2次,每次2 h,上清液經濃縮、醇沉、干燥后即為香菇柄多糖。

1.2.1.2 多糖和蛋白質含量的測定

采用苯酚-硫酸法[16]測定多糖含量；采用考馬斯亮藍G-250法[17]測定蛋白質含量。

1.2.2 香菇柄多糖的乙酰化修飾

1.2.2.1 NaOH-乙酸酐法修飾多糖

參照文獻[18]方法對多糖進行乙酰化修飾,乙酸酐用量分別為1、5、10 mL,反應結束后經透析、醇沉、干燥,即為乙酰化多糖,分別標記為NaOH乙酰化多糖1、NaOH乙酰化多糖5、NaOH乙酰化多糖10,用于后續測定。

1.2.2.2 甲酰胺-乙酸酐法修飾多糖

參照文獻[8,19]方法進行多糖乙酰化修飾,乙酸酐用量分別為1、5、10 mL,經透析、醇沉、干燥,即為乙酰化多糖,分別標記為甲酰胺乙酰化多糖1、甲酰胺乙酰化多糖5、甲酰胺乙酰化多糖10,用于后續測定。

1.2.3 測定方法

乙酰基取代度的測定:采用酸堿滴定法測定乙酰化取代度[20]。

紫外光譜分析:將香菇柄多糖及其乙酰化多糖制成0.2 mg/mL水溶液,于190～800 nm下進行掃描。

紅外光譜分析:稱取香菇柄多糖及其乙酰化多糖樣品各5 mg,與200 mg經過干燥的溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨均勻,壓片后用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1進行光譜掃描。

剛果紅實驗:參照文獻[21]測定三螺旋結構。

抗氧化活性測定:參照文獻[8]對DPPH自由基清除率和還原能力進行測定。

1.3 數據分析

所有實驗重復3次,用平均值±標準偏差(mean±SD)表示。采用SPSS軟件進行差異顯著性分析,GraphPad Prism軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 香菇柄乙酰化多糖的制備

香菇柄多糖乙酰化修飾的乙酰基取代度如表1所示,香菇柄多糖提取物中的多糖含量為36.42 g/100 g,經乙酰化修飾后,隨著乙酸酐用量的增加,NaOH體系乙酰化修飾的多糖含量逐漸增大,而甲酰胺體系乙酰化修飾的多糖含量顯著減小(P<0.05)；蛋白質含量為17.12 g/100 g,經乙酰化修飾后,隨著乙酸酐用量的增加,NaOH體系和甲酰胺體系乙酰化修飾多糖中的蛋白質含量均顯著減少(P<0.05),與MA等[22]報道的樺褐孔菌多糖化學修飾后蛋白質含量下降的結果一致。隨著乙酸酐用量的增加,NaOH體系和甲酰胺體系乙酰化多糖的取代度均呈上升趨勢,并且NaOH體系乙酰化多糖的取代度及其增幅顯著高于甲酰胺體系乙酰化多糖。邵珠領等[20]對樺褐孔菌多糖進行了乙酰化修飾,發現樺褐孔菌多糖乙酰基的取代度隨乙酰化修飾試劑用量增大呈上升趨勢,與本結果相似。在乙酸酐用量為5 mL時,NaOH體系和甲酰胺體系乙酰化多糖均可獲得較好的取代度,分別為0.31和0.14。這一結果說明乙酸酐用量對香菇柄多糖的乙酰基取代有重要影響。

表1 香菇柄多糖乙酰化修飾取代度及多糖和蛋白質含量Table 1 Substitution degree and contents of polysaccharide and protein of acetylated modification of L.edodes stipe polysaccharide

2.2 紫外光譜和紅外光譜分析

由圖1可知,與粗多糖相比,NaOH體系乙酰化多糖和甲酰胺體系乙酰化多糖在260和280 nm處的紫外吸光值均呈現出明顯的下降趨勢,并且隨著乙酸酐用量的增加,在260和280 nm處的紫外吸光值越小,表明乙酰化過程對脫除多糖中的蛋白質具有一定的作用。這一結果與表1中蛋白質含量測定結果一致。

從圖2可以看出,香菇柄多糖及NaOH體系乙酰化多糖和甲酰胺體系乙酰化多糖都具有多糖的特征吸收峰。3 416 cm-1左右為糖分子內或分子間氫鍵O—H伸縮振動峰,2 932 cm-1為次甲基(—CH2—)中的C—H的伸縮振動的吸收峰。

a-NaOH體系乙酰化多糖;b-甲酰胺體系乙酰化多糖圖2 香菇柄多糖及其乙酰化多糖的紅外光譜圖Fig.2 The FT-IR spectra of L.edodes stipe polysaccharide and its acetylated polysaccharide

2.3 剛果紅實驗

剛果紅是一種酸性染料,可與具有三螺旋鏈構象的多糖形成配合物,配合物的最大吸收波長與剛果紅相比發生紅移[21]。香菇柄多糖及其乙酰化多糖與剛果紅在不同NaOH濃度下溶液的最大吸收波長λmax的變化如圖3所示。香菇柄多糖及NaOH體系乙酰化多糖與剛果紅的混合溶液λmax均發生了紅移,表明NaOH體系乙酰化多糖具有三螺旋結構；甲酰胺體系乙酰化多糖1與剛果紅的混合溶液λmax發生了輕微的紅移,其余甲酰胺乙酰化多糖與剛果紅的混合溶液及剛果紅對照溶液的λmax均沒有發生紅移,表明甲酰胺體系乙酰化多糖不具有三螺旋結構,造成這一現象的原因可能是由于甲酰胺體系乙酰化過程中未對溶液pH值進行調整,溶液pH值較小,多糖的三螺旋結構在酸性條件下被破壞；而NaOH體系乙酰化多糖在乙酰化過程中pH值始終保持在8～9,沒有破壞多糖的三螺旋結構。出現這一結果可能與分子間氫鍵是否被破壞有關[11]。

圖3 不同NaOH濃度下香菇柄多糖及其乙酰化多糖與 剛果紅配合物的λmax變化Fig.3 λmax changes of Congo with L.edodes stipe polysaccharide and its acetylated polysaccharide complex under various concentrations of sodium hydroxide

2.4 乙酰化修飾對香菇柄多糖體外抗氧化活性的影響

從圖4-a可以看出,在實驗濃度范圍內,隨著多糖濃度的增大,香菇柄多糖及NaOH體系和甲酰胺體系乙酰化多糖對DPPH自由基清除率均呈增強趨勢。在多糖質量濃度小于4 mg/mL時,香菇柄多糖和NaOH乙酰化多糖1對DPPH自由基清除率高于NaOH乙酰化多糖5和10,之后繼續增大多糖濃度,則低于NaOH乙酰化多糖5和10對DPPH自由基的清除率；在多糖質量濃度為8 mg/mL時,NaOH乙酰化多糖1、5和10對DPPH自由基清除率比香菇柄多糖(41.76%)分別高4.51%、11.15%和12.29%。而甲酰胺乙酰化多糖對DPPH自由基清除率則低于香菇柄多糖,且取代度越大,清除能力越弱；在多糖質量濃度為8 mg/mL時,甲酰胺乙酰化多糖1、5和10對DPPH自由基清除率比香菇柄多糖分別低3.39%、12.42%和15.84%。相關研究表明,多糖經乙酰化修飾后其抗氧化活性表現不一,如邵珠領等[20]研究發現乙酰化樺褐孔菌多糖對DPPH自由基清除能力高于未乙酰化修飾多糖。而徐田甜等[18]研究發現乙酰化松樹蕈多糖對DPPH自由基清除活性比未修飾的活性低。出現這一現象可能是因為乙酰化修飾之所以能夠對多糖活性產生影響,不僅與取代度有關,還與取代位置、以及反應過程中多糖結構是否被破壞有關[6,18,24]。

a-DPPH清除能力;b-還原力圖4 香菇柄多糖及其乙酰化多糖對DPPH自由基的清除 作用及還原力的影響Fig.4 Scavenging capacities of L.edodes stipe polysaccharide and its acetylated polysaccharide on DPPH free radicals and its reducing power

根據還原能力的測定方法,在波長700 nm測定的吸光值越大,則表明樣品的還原能力越強。由圖4-b可知,在實驗所測定的濃度范圍內,NaOH乙酰化多糖的還原能力高于香菇柄多糖,且隨著乙酰化試劑用量的增大,多糖的還原能力增強；而甲酰胺乙酰化多糖的還原能力低于香菇柄多糖,并且隨著乙酰化試劑用量的增大,還原能力逐漸減弱。

HU等[8]研究發現經甲酰胺體系乙酰化修飾后的藤五加多糖的還原能力弱于未乙酰化修飾多糖,與本研究結果相似。出現這一現象可能是由于乙酰化修飾改變了多糖分子的定向性和橫向次序,從而改變糖鏈的空間排布,減少了活性羥基的密度進而阻止了乙酰基與金屬離子的結合,進而降低了還原能力[8,20]。

3 結論

隨著乙酸酐用量增加,NaOH體系和甲酰胺體系乙酰化修飾香菇柄多糖的乙酰化取代度均呈上升趨勢,乙酰化取代度與乙酸酐用量呈正相關。在乙酸酐用量為5 mL時,可以得到較好的取代度。紫外光譜表明,香菇柄多糖乙酰化修飾前后基本趨勢一致。紅外光譜表明,乙酰化修飾香菇柄多糖除具有多糖特征峰外,還出現了乙酰基的特征吸收峰,表明香菇柄多糖的乙酰化修飾成功。NaOH體系乙酰化修飾后多糖仍然具有三螺旋結構,而甲酰胺體系乙酰化修飾后多糖的三螺旋結構被破壞。隨著多糖濃度的增加,香菇柄多糖及NaOH體系和甲酰胺體系乙酰化多糖的抗氧化能力均增強。且NaOH體系乙酰化多糖的抗氧化活性強于香菇柄多糖,甲酰胺體系乙酰化多糖的抗氧化活性弱于香菇柄多糖。