改性豆渣膳食纖維的理化性質、結構及其益生活性研究

尹立晨,童群義

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

膳食纖維被稱為第七大營養素,根據其溶解性可分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber,IDF)[1]。與IDF相比,SDF具有更多的功能特性,通常也會提供更好的質地和口感,因此常用于食品加工。豆渣含有豐富的蛋白質、脂肪、膳食纖維等,是天然的膳食纖維來源,其可食性和安全性已被人們認可。但豆渣膳食纖維(okara dietary fiber,ODF)大多是不溶性的,SDF含量低限制了其在食品工業中的應用[2]。因此,需要對ODF進行改性處理以提高其SDF含量,在增強其適口性的同時,強化其功能特性。

目前,ODF改性主要有3種方法,即物理法、化學法和酶法。高速剪切(high-speed shearing,HSS)是一種物理改性方法,它通過強烈的剪切、分散、沖擊和湍流作用,使原料在剪切縫中被剪切、壓縮和折疊。因此,原料能在短時間內得到良好的微粉化、乳化、混合和均勻化。基于上述優勢,HSS已成功應用于食品工業,用于分解果膠、降解殼聚糖和番茄纖維的結構修飾[3-5]。酶處理可使纖維素、半纖維素分子分解成小分子糖或單糖,并且處理工藝條件溫和、特異性強、反應時間短、副產物少、純度高。已有研究表明,相較于纖維素酶或木聚糖酶的單一酶解改性,復合酶處理更能顯著地提高SDF的含量[6]。然而,酶處理過程中酶與底物的接觸不均勻常會導致酶解改性效果不顯著。因此，近年來,也出現了一些聯合改性方法。高辰等[7]采用酶解和擠壓結合處理ODF,與單獨處理相比,2種方法結合處理后的ODF粒度更小,黏度更低,抗氧化能力、吸附膽固醇和陽離子交換能力更高。

膳食纖維雖然難以被人體消化吸收,但可被益生菌部分或全部發酵,促進腸道內有益菌增殖,進而維護腸道健康[8]。王津等[9]研究發現,茶葉膳食纖維可顯著增加乳酸菌、雙歧桿菌數量,同時顯著降低腸桿菌、腸球菌和產氣莢膜梭菌的數量。ODF作為一種來源廣且安全性高的膳食纖維,關于其促進益生菌生長的研究鮮有報道。因此,本文采用高速剪切、復合酶解、高速剪切協同酶解改性ODF,并比較3種改性方法對ODF理化性質、結構以及益生活性的影響,旨在為提高ODF的益生活性和豆渣資源的綜合開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣,上海清美綠色食品有限公司,其基本組成成分如下：水分(8.26±0.31)%、灰分(4.42±0.33)%、脂肪(1.76±0.18)%、蛋白質(14.30±0.49)%、總膳食纖維(total dietary fiber,TDF)(69.88±1.04)%、IDF(67.16±1.38)%、SDF(2.32±0.17)%；木瓜蛋白酶(100 U/mg)、纖維素酶(50 U/mg)、木聚糖酶(50 U/mg),蘇州卓鑫生物科技有限公司；玉米油,益海(泰州)糧油工業有限公司；菊粉,淄博益生康緣生物科技有限公司；95%乙醇(分析純)、葡萄糖(分析純),國藥集團化學試劑有限公司；嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC 4356)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalissubsp.LactisATCC 700541),廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

GFX-GF-101-2BS 電熱鼓風干燥箱,上海躍進醫療器械廠；AB104-N 電子分析天平、梅特勒FE28K pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司；SF-100 不銹鋼高速粉碎機,上海船浜制藥粉碎設備廠；HH-2k8 恒溫水浴鍋,鞏義市予華儀器有限公司；RJ-LD-50G 低速離心機,無錫市瑞江分析儀器有限公司；致微GI80T 立式自動壓力蒸汽滅菌器,廈門致微有限公司；R205B 旋轉蒸發儀,上海申順科技有限公司；T18 數顯型分散機套裝,廣州儀科實驗室技術有限公司；SCIENTZ-18 N 冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司；S3500 激光粒度分析儀,美國Microtrac公司；SU8100 冷場發射掃描電子顯微鏡,日本株式會社日立高新技術；IS10D2 傅里葉紅外光譜儀,美國Nicolet公司；PHASER X射線衍射儀,德國布魯克AXS有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺,蘇州凈化有限公司；AW500SG 厭氧工作站,英國Electrotek公司；GH-400BC 隔水式恒溫培養箱,北京市永光明醫療儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 ODF的制備

參考張慧霞[10]的方法并稍作修改,稱取新鮮豆渣,在60 ℃下烘干,用粉碎機粉碎后過100目篩得到豆渣粉。按料液比1∶20 (g∶mL)加入蒸餾水攪拌均勻,再加入1%木瓜蛋白酶,55 ℃酶解2 h后沸水滅酶5 min,在4 500 r/min下離心15 min,收集沉淀,冷凍干燥,粉碎得到ODF。

1.3.2 ODF的改性

1.3.2.1 高速剪切法

取制備好的ODF,按料液比1∶25(g∶mL)加入蒸餾水攪拌均勻,以15 000 r/min的速率剪切分散15 min。倒入4倍體積的95%(體積分數)乙醇溶液,靜置醇沉12 h,在4 000 r/min下離心10 min,收集沉淀,冷凍干燥得到樣品,記為H-ODF。

1.3.2.2 復合酶解法

取制備好的ODF,按料液比1∶25(g∶mL)加入蒸餾水攪拌均勻,再加入質量分數1.6%的復合酶[m(纖維素酶)∶m(木聚糖酶)=1∶1],用濃度為0.1 mol/L的HCl溶液調節pH至5.0,55 ℃酶解2 h后沸水滅酶5 min,倒入4倍體積的95%乙醇溶液,靜置醇沉12 h,在4 000 r/min下離心10 min,收集沉淀,冷凍干燥得到樣品,記為E-ODF。

1.3.2.3 高速剪切協同酶解法

取制備好的ODF,按料液比1∶25(g∶mL)加入蒸餾水攪拌均勻,以15 000 r/min的速率剪切分散15 min,再加入1.6%的復合酶[m(纖維素酶)∶m(木聚糖酶)=1∶1],用濃度為0.1 mol/L的HCl調節pH至5.0,55 ℃酶解2 h后沸水滅酶5 min,倒入4倍體積的95%乙醇溶液,靜置醇沉12 h,在4 000 r/min下離心10 min,收集沉淀,冷凍干燥得到樣品,記為HE-ODF。

1.3.3 改性豆渣膳食纖維的理化性質

1.3.3.1 持水力(water holding capacity,WHC)測定

參考胡筱等[11]的方法,稱取樣品1 g于50 mL離心管中,加入25 mL蒸餾水,振蕩均勻,室溫下靜置24 h,4 000 r/min離心20 min,棄去上清液,用濾紙吸干殘液,稱重。WHC計算如公式(1)所示。

(1)

式中：m0,樣品干重,g；m1,離心管質量,g；m2,吸水后樣品和離心管質量,g。

1.3.3.2 膨脹力(swelling capacity,SC)測定

參考胡筱等[11]的方法,稱取樣品1 g于50 mL量筒中,測定干樣體積,加入30 mL蒸餾水,攪拌均勻,室溫下靜置24 h,測定膨脹后體積。SC計算如公式(2)所示。

(2)

式中：m0,樣品干重,g；V0,干樣體積,mL；V1,膨脹體積,mL。

1.3.3.3 持油力(oil holding capacity,OHC)測定

參考牛希等[12]的方法,稱取樣品1 g于50 mL離心管中,加入25 mL玉米油,振蕩均勻,室溫下靜置24 h,4 000 r/min離心20 min,棄去上層油,用濾紙吸干殘液,稱重。OHC計算如公式(3)所示。

(3)

式中：m0,樣品干重,g；m1,離心管質量,g；m2,吸油后樣品和離心管質量,g。

1.3.4 粒徑分析

稱取樣品10 mg于燒杯中,加入10 mL蒸餾水,超聲分散均勻后,設定樣品和水的折射率分別為1.470和1.330,用激光粒度儀測定其顆粒的粒徑分布狀況。

1.3.5 掃描電子顯微鏡分析

取少量樣品,用雙面導電膠固定在樣品臺上,洗耳球輕吹樣品表面,然后離子濺射噴金,置于掃描電子顯微鏡觀察臺上進行微觀結構觀察。設置加速電壓為3 kV,放大倍數為3 000倍。

1.3.6 傅里葉紅外(Fourier transform infrared,FT-IR)光譜分析

稱取樣品1 mg于瑪瑙研缽中,加入100 mg溴化鉀晶體,在紅外燈照射下輕輕研磨至極細,使用手動壓片機壓制成薄片,立即在400～4 000 cm-1下進行紅外光譜掃描,測定FT-IR光譜曲線。

1.3.7 X-射線衍射分析

取適量樣品,磨細后放入樣品槽,用表面光滑的玻璃板壓實表面,將樣品槽插入儀器測定。測定參數為：靶型Cu靶,管電流10 mA,管電壓30 kV,步寬0.02°,掃描速率6°/min；掃描范圍：5～60°。

1.3.8 改性豆渣膳食纖維的體外發酵

參考張夢云[13]的方法,按質量分數2%分別加入葡萄糖、菊粉、ODF、H-ODF、E-ODF、HE-ODF至MRS培養基振蕩溶解,高壓滅菌。分別取嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌凍干粉接種于10 mL滅菌的MRS培養基中,培養12 h。再取1 mL活化后的菌液,搖勻,分別接種于10 mL添加不同碳源的液體培養基中,在厭氧條件下37 ℃恒溫培養箱中培養72 h,定時取菌液測定活菌數和pH值。

1.4 數據處理和分析

每組實驗重復3次,結果以(平均值±標準差)表示,采用SPSS 25.0進行數據分析,采用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 改性豆渣膳食纖維的基本成分

由表1可知,改性處理對ODF的水分、灰分、脂肪、蛋白質均無顯著性影響。3種改性方法均輕微提高了TDF的含量,而SDF質量分數經改性后則有顯著增加(P<0.05),相應的IDF質量分數降低,表明改性處理使得部分IDF轉化為SDF。3種改性樣品中,HE-ODF組的SDF質量分數最高,顯著高于單獨采用酶法改性組,由此表明,高速剪切處理可以提高酶對底物的作用效率,使更多的纖維素、半纖維素等不溶性成分水解為可溶性小分子。

表1 不同方法改性ODF前后的基本成分Table 1 Chemical components of raw and modified okara dietary fiber

2.2 改性豆渣膳食纖維的理化性質

WHC和SC反映了膳食纖維的水合能力,是衡量膳食纖維保水性能的重要指標。由圖1可知,經3種方法改性后,ODF的WHC和SC均有不同程度的提高,其中復合酶法改性效果優于高速剪切法,WHC從改性前的(5.49±0.17)g/g分別提高到了(5.95±0.22)和(6.58±0.05)g/g,SC由(6.16±0.22)mL/g分別提高到了(6.51±0.11)和(7.22±0.16)mL/g,而兩者協同處理的改性效果最佳,WHC和SC分別為(7.89±0.12)和(7.39±0.19)mL/g。膳食纖維的水合能力通常受纖維的結構和水結合位點的數量影響[14],經高速剪切處理后由于纖維粒徑減小,結構變得疏松多孔,釋放了更多的水結合位點,因此具有更好的捕獲水的能力。而復合酶解則可以打破半纖維素和纖維素之間的β-糖苷鍵,使得羥基、羧基和氨基等更多的親水基團暴露出來,因此可以結合更多的水分子。有研究表明,膳食纖維的水合能力與SDF的含量呈正相關[15],上述結果與改性前后膳食纖維的SDF含量測定結果一致,進一步證實了這一結論。

OHC反映了膳食纖維結合油的能力,高OHC值有利于食品在加工過程中保留油脂。由圖1可知,高速剪切和酶法改性都能顯著提高ODF的OHC,從改性前的(2.13±0.08)g/g分別提高到了(2.47±0.06)和(3.26±0.11)g/g。有研究表明,OHC與纖維顆粒的表面結構、疏水性和總電荷密度有關[16]。高速剪切和復合酶解過程中剪切力和酶的作用使得纖維原本緊密的結構變得疏松,比表面積增大,孔隙增多,因此油滴更容易被吸附。

圖1 不同方法改性ODF前后的理化性質Fig.1 Physicochemical properties of raw and modified okara dietary fiber注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 改性豆渣膳食纖維的粒徑分布

ODF改性前后的粒徑分布如圖2所示,改性后ODF的粒徑分布圖的峰均有不同程度的往左偏移,說明3種改性方法均可有效地使ODF的粒徑減小。對于未經改性處理的ODF,其粒徑主要分布在6.54～837.10 μm,主峰處所對應的粒徑為176 μm,其微分分布為8.57%,相對而言粒徑較大,分布范圍較廣；經高速剪切改性后ODF的粒徑分布相對集中,峰較窄,所對應的粒徑為104.6 μm,其微分分布為9.29%；而經復合酶解改性后的ODF出現了2個峰,對應的粒徑分別為73.99和26.16 μm,其微分分布分別為8.95%和5.66%；兩者協同改性的ODF峰較未改性向左偏移得最多且分布變寬,說明纖維顆粒被破碎得最為明顯且大小越來越均勻。

將ODF改性前后粒徑分布數據進行統計處理,結果如表2所示。高速剪切和復合酶解改性后ODF的D[4,3]由170.97 μm分別下降為123.85和68.13 μm；而兩者協同處理后,ODF的D[4,3]更是下降到只有27.10 μm,說明高速分散處理破壞了豆渣纖維基質,使其變得不連續且疏松,而纖維素和半纖維素在復合酶的作用下水解成小分子。減小的粒徑和增加的表面積促進了酶促水解和結構崩潰。已有研究表明,小粒徑和大表面積更易被益生菌發酵利用[17]。因此,通過改性處理,ODF的小顆粒可為益生菌提供更多的吸附表面積,在發酵過程中為益生菌的生長提供碳源,其作為益生元的潛力增大。

圖2 不同方法改性ODF前后的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of raw and modified okara dietary fiber

表2 不同方法改性ODF前后的粒徑分布

單位：μm

2.4 改性豆渣膳食纖維的微觀結構

ODF改性前后放大3 000倍的微觀結構如圖3所示。未改性的ODF結構緊密,表面光滑無裂縫,并有部分粗顆粒附著,可能是殘余的蛋白顆粒[6]；H-ODF的結構較為松散,表面褶皺和裂紋增多,由此表明強烈的剪切作用促進了纖維顆粒的破裂,形成了較大的孔隙率；E-ODF的表面結構呈現蜂窩狀的多孔性特征,這可能是纖維素和半纖維素的酶解導致纖維網狀結構被破壞并顯著提高其表面的粗糙程度；HE-ODF的表面結構最不規則且最粗糙,凹陷和褶皺明顯,比表面積增大,暴露出了更多的活性基團,同時,纖維分子斷裂導致分子質量降低,聚合度減小,這說明剪切后再進行酶解處理可以使酶作用更深入纖維分子內部,使原來排列緊密的纖維素分子結構變得更加疏松,這與YU等[18]改性胡蘿卜皮渣不溶性膳食纖維的結構表征結果相似。改性后,HE-ODF的松散結構、大表面積以及多孔性特征為其與水、油脂和益生菌的吸附結合提供了微觀結構基礎,因而提高了其持水力等理化性質以及益生菌對其發酵利用的能力。

a-ODF；b-H-ODF；c-E-ODF；d-HE-ODF圖3 不同方法改性ODF前后的掃描電子顯微鏡圖Fig.3 SEM images of raw and modified okara dietary fiber

2.5 改性豆渣膳食纖維的FT-IR光譜分析

如圖4所示,改性前后ODF的FT-IR光譜大致相似,呈現典型的纖維類多糖特征吸收峰,只在一些特征波段存在差異。其中3 434 cm-1附近較強的吸收峰是纖維素、半纖維素的O—H伸縮振動,改性后其強度有所減弱,可能是纖維素分子間的氫鍵斷裂引起[19]。2 927 cm-1處的弱峰是多糖甲基和亞甲基上的C—H伸縮振動。1 646 cm-1處是木質素中苯環的特征吸收峰,1 250和1 050 cm-1處是纖維素和半纖維素的2種C—O伸縮振動峰,經剪切、酶解改性后,所對應的峰強度均有所下降,表明ODF中一部分纖維素、木質素被降解,此結果與YANG等[20]的研究結果一致。此外,673 cm-1附近的小吸收峰減弱甚至消失了,可能是一些不溶性纖維在降解后溶出,離開了原有的ODF結構。

圖4 不同方法改性ODF前后的傅里葉紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of raw and modified okara dietary fiber

綜上,高速剪切和酶解改性處理并未改變ODF的基本化學結構,同時,一些特征峰強度之間的差異表明了改性處理有效地去除了ODF中纖維素、木質素等不溶性成分。

2.6 改性豆渣膳食纖維的X射線衍射

如圖5所示,改性前后ODF的X射線衍射圖像在形狀上相似,均在衍射角16和22°左右處有顯著的結晶衍射峰,在34°處有1個弱衍射峰,顯示出典型的Ⅰ型纖維素晶體構型。由此說明無論是高速剪切還是復合酶解處理,均未改變ODF的晶體構型。其中,H-ODF較ODF的衍射峰強度減弱且峰寬增加,表明結晶度減小。強烈的剪切作用導致ODF纖維素和半纖維素的晶體結構被破壞,從而引起ODF結晶度的降低。CHEN等[21]也報道了類似的結果,干介質研磨降低了糯米淀粉的粒度和結晶度。而E-ODF較ODF的衍射峰強度增加且峰型變尖銳,表明結晶度增加。纖維素由D-吡喃葡萄糖單元通過β-1,4糖苷鍵連接而成,具有結晶部分和無定形部分；半纖維素通常與纖維素微纖維相連,具有隨機和無定形結構,并且強度很小,很容易被各種半纖維素酶水解[22]。因此可以推斷,E-ODF結晶度的增加主要是由于半纖維素和纖維素中的無定形部分水解造成的。

圖5 不同方法改性ODF前后的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction diagram of raw and modified okara dietary fiber

2.7 改性豆渣膳食纖維的體外益生活性

2.7.1 改性豆渣膳食纖維對益生菌生長曲線的影響

由圖6-a可知,在以葡萄糖和菊粉為碳源的培養基中,嗜酸乳桿菌在0～24 h和0～36 h生長迅速,之后活菌數顯著下降,這是由于葡萄糖和菊粉溶解性高,作為碳源更易被菌利用,但在達到最大生長量后,培養基內碳源的減少和酸度的增加導致菌生長受到抑制,活菌數減少。在以未改性和改性后的ODF為碳源的培養基中,嗜酸乳桿菌在0～36 h的生長初期雖然長勢不如葡萄糖和菊粉培養基,但在36～72 h的生長后期仍能保持增長,這表明膳食纖維的碳源供應持久性優于葡萄糖和菊粉。未改性和3種不同改性方法處理的ODF對嗜酸乳桿菌的生長促進作用不同,具體表現為HE-ODF>E-ODF>H-ODF>ODF。這表明,ODF經改性處理后,更易被益生菌利用,其作為益生元的潛力提高。由圖6-b可知,乳雙歧桿菌在不同碳源中的生長變化情況與嗜酸乳桿菌類似,只是利用效率較嗜酸乳桿菌低一些,這可能是由于不同菌種的酶分泌基因不同導致其對不同碳源的利用能力產生差異[23]。此外,不同菌種對逆環境的耐受能力不同也會導致其對菌種的生長增殖產生影響[24]。

綜上可知,ODF相較于葡萄糖和菊粉,可為嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌生長增殖提供更加持久的碳源供應,從而維持活菌數量的穩定。ODF的發酵性能受SDF組分含量、粒徑、表面積、結晶度等因素的影響[25]。與ODF相比,H-ODF、E-ODF和HE-ODF表現出更強的促益生菌生長能力,且HE-ODF的能力更強,甚至在72 h后優于菊粉,這可能是因為改性后ODF中可溶性組分含量提高、粒徑減小、表面積增大,從而更易被益生菌吸附利用,并在較長的發酵時間內為益生菌的生長增殖持續提供碳源。

a-嗜酸乳桿菌；b-乳雙歧桿菌圖6 兩種益生菌在不同碳源培養基中的生長曲線Fig.6 Growth curve of two probiotics in medium with different carbon sources

2.7.2 改性豆渣膳食纖維對益生菌發酵過程中pH的影響

由圖7可知,隨著培養時間的增加,2種益生菌在各個培養基中的pH都在不斷下降。其中,空白培養基的pH在整個發酵過程中僅有輕微的下降,葡萄糖、菊粉和各ODF培養基的pH在0～12 h急劇下降,12～72 h緩慢下降。由生長曲線可知,0～12 h活菌數迅速增長,產酸量增加導致pH快速降低。12 h后,過酸的環境使得益生菌生長受到抑制,活菌數增長減慢,產酸能力減低,pH下降速度放緩[26]。此外,4種ODF培養基中,未改性的ODF培養基pH下降幅度最小,HE-ODF培養基pH下降幅度最大,這進一步證明了ODF經高速剪切協同酶解改性后更容易被益生菌利用,產生更多的游離酸,從而降低pH,在一定程度上抑制人體腸道中有害菌的生長,維持腸道微環境的平衡。

a-嗜酸乳桿菌；b-乳雙歧桿菌圖7 兩種益生菌在不同碳源培養基中pH的變化曲線Fig.7 pH of two probiotics in medium with different carbon sources

3 結論

本文通過高速剪切、復合酶解、高速剪切協同酶解改性ODF,分析了其改性后顆粒結構、理化性質和益生活性的變化。結果表明,3種改性方法均能有效地增加ODF中的可溶性組分含量、減小粒徑,同時使其纖維網狀結構破壞,褶皺和裂紋增多,暴露出更多的活性基團,進而顯著提高其持水性、持油性和膨脹力等理化性質。3種改性方法均能增強ODF對2種益生菌的增殖作用,且對嗜酸乳桿菌的增殖作用較乳雙歧桿菌更明顯。此外,由于高速剪切協同酶解改性更能細化纖維結構,增加可溶性組分含量,因此其處理的ODF體外益生活性增加最為顯著。綜上所述,高速剪切協同酶解作為一種優良的ODF改性方法,可為改善ODF理化性質和益生活性提供理論依據。