添加洋蔥汁和二氧化硫的赤霞珠紅葡萄酒發酵的比較

袁夢,馬雷,李杰,付冬梅,孫玉梅

(大連工業大學 生物工程學院,遼寧 大連,116034)

抑菌和防氧化對葡萄酒釀造非常重要。SO2的抑菌和抗氧化活性使其成為葡萄酒釀造中的基本添加劑[1-2]。但SO2對人體健康有負面影響,因此,研究者們努力尋找合適的SO2替代品以盡量減少SO2用量,諸如：抗壞血酸、谷胱甘肽、二碳酸二甲酯[3]、酚類物質[4]和膠體銀[5]等化合物,以及對環境友好和食用安全的天然替代品,包括酵母泥、酵母衍生物[3]、黑蘿卜提取物[6]、葡萄籽、葡萄梗以及葡萄藤枝條的提取物[7-9]、殼聚糖[10-11]、溶菌酶[3-4]、那他霉素和細菌素[3,12]。膠體銀處理的葡萄酒在化學及感官特性方面與SO2處理效果相似[5]。黑蘿卜提取物不僅對紅葡萄酒的抗氧化活性和揮發酸與SO2處理效果相似,還改善了酒的感官特性,可降低SO2用量[6]。但目前仍未找到能完全替代SO2的物質。

百合科蔥屬的洋蔥種植廣泛,不僅含有蛋白質、碳水化合物、粗纖維、脂肪、維生素等植物營養素,還含有有機硫化物(比如亞磺酸酯、蒜素類化合物)、甾體皂苷類、黃酮類、苯丙素酚類等化合物和前列腺素等活性組分[13]。這些成分使洋蔥具有降低血栓、血糖和血脂、穩定血壓、抑菌、消炎、抗氧化以及抑制癌細胞等作用[13],其中的多酚、粗多糖、類黃酮化合物、含硫化合物(比如亞磺酸酯、蒜素類化合物)能有效抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,對釀酒酵母、白假絲酵母、新生隱球菌、黑曲霉、黃曲霉、紅曲霉和青霉等真菌有較強抑制作用,最低抑菌濃度為0.25%～0.50%[13-18]。洋蔥含有的花青素、類黃酮、酚類化合物、槲皮素和多糖具有抗氧化能力[13,19]。但是目前還未見關于洋蔥汁替代SO2在葡萄酒發酵中應用的報道。

基于洋蔥的抑菌活性和抗氧化活性,本實驗室前期對添加2、5和8 g/L洋蔥汁的葡萄酒發酵進行了對比實驗[20]。本文通過測定在赤霞珠葡萄酒自然發酵和商業活性干酵母接種發酵的過程中微生物種群、還原糖、乙醇、pH值、總酸度、色度和氧化還原電位的動態,以及最終葡萄酒的褐變程度和揮發酸,分析比較了添加洋蔥汁和SO2的葡萄酒發酵效果。

1 材料與方法

1.1 原料

釀酒用赤霞珠葡萄,2015年10月采自河北昌黎；普通紅皮洋蔥,大連農貿市場；葡萄接種發酵所用ST商業酵母(Zymaflore ST),遼寧五女山米蘭酒業有限公司。實驗用化學試劑分別為化學純、分析純及色譜純化學試劑。

1.2 儀器

PHS-3C型精密pH計、722S型分光光度計以及ORP復合電極,上海精密科學儀器有限公司；HITACHI CR21 GⅢ離心機,日本日立工機株式會社；Agilent6850氣相色譜儀、DB-FFAP(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱以及7697A頂空進樣器,安捷倫科技有限公司；SHP-350生化培養箱,上海精宏實驗設備有限公司；WYT-5折射計,上海光學儀器廠。

1.3 洋蔥汁制備

選取新鮮普通紅皮洋蔥,剝去外皮,切成小塊后用料理機粉碎混勻,獲得洋蔥汁。

1.4 商業活性干酵母活化

活性干酵母(2 g)溶解在10 mL無菌水中,40 ℃保溫15 min,每5 min輕輕攪拌1次,隨后補加10 mL葡萄汁,于25 ℃保溫1 h,每30 min輕輕攪拌1次。最后的混合物作為酵母接種物。

1.5 葡萄酒發酵

將未病、未破裂的新鮮葡萄去梗、壓碎后,將果漿和果渣均勻分裝到1 000 mL錐形瓶,每瓶裝450 mL葡萄漿,用棉塞封瓶,發酵48 h后用發酵栓取代棉塞。在不接種的自然發酵和接種了200 mg/L商業酵母(即2 mL/L酵母活化液)的情況下,于15 ℃靜置發酵。兩種發酵分別補充50 mg/L SO2、50 g/L新鮮圓蔥汁和無菌水,加無菌水的作為對照,3種補充均以加入洋蔥汁的體積為準,不足的體積均用無菌水補齊,以保證對葡萄汁發酵體系的稀釋程度相同。每個處理1式3份,每天2次手動搖勻30 s,定期取樣。直到測定指標變化較小結束發酵測定。

1.6 化學成分測定

發酵葡萄漿或葡萄酒在4 ℃、10 640×g無菌離心10 min獲得的上清液,經適當稀釋后進行化學分析。采用滴定法測定總酸度(以酒石酸計算)；用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法檢測還原糖含量[1]。

采用氣相色譜法定量測定乙醇和乙酸。將10 mL樣品和2 g NaCl加入20 mL頂空瓶中,磁力攪拌至NaCl完全溶解。進樣前,將樣品在90 ℃下平衡30 min。將2 μL樣品注射到進樣口,加熱到250 ℃。定量回路維持在100 ℃,傳輸管溫度110 ℃,采樣時間0.5 min。火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID)溫度250 ℃,載氣為氮氣,流速10 mL/min,柱壓7.2 psi,空氣流速300 mL/min,氫氣流速30 mL/min,分流比10∶1。色譜柱起始溫度40 ℃,維持5 min,5 ℃/min上升至190 ℃,維持1 min,然后以20 ℃/min升溫至230 ℃,維持2 min[1]。

1.7 pH和氧化還原電位測定

采用502環形ORP復合電極測量樣品的氧化還原電位,以白金環為指示電極,以銀-氯化銀為參比電極,并配以PHS-3C酸度計。測量前,用飽和醌氫醌對電極進行校準。每個樣品在3 min內完成測量。

1.8 色度和褐變度測定

用722S分光光度計進行色度分析[21]。用去離子水(10倍)稀釋樣品,在1 cm的比色皿中,在420、520和620 nm處測定吸光度A420、A520和A620。樣品的色強為A420、A520和A620之和。褐變度為420 nm處的吸光度[22]。

1.9 微生物計數測定

采用菌落計數法。用8.5 g/L NaCl溶液連續稀釋的0.1 mL樣品均勻涂布在無菌的瓊脂平板上,30 ℃培養至菌落數量基本穩定,以CFU/mL進行活細胞計數。

分別用肉湯瓊脂培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium,YEPD)和察氏瓊脂培養基對細菌、酵母和霉菌進行計數。所有培養基在121 ℃滅菌20 min,然后加入0.22 μm微孔膜過濾滅菌的抗生素。肉湯瓊脂培養基中添加0.012 5%的霉菌素,分別在YEPD瓊脂培養基和察氏瓊脂培養基中添加32 000 U/L青霉素和40 000 U/L鏈霉素[1]。

1.10 統計分析

使用SPSS 17.0軟件包對數據進行差異顯著性統計分析。數據采用方差分析,均數之間的差異采用Tukey檢驗,概率水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同處理的葡萄酒發酵過程的微生物種群量比較

葡萄酒發酵系統的微生物構成復雜,包括釀酒酵母、非釀酒酵母、細菌和霉菌等。由圖1可見,在接種發酵整個過程中,不同處理的各種微生物量均無顯著差異(P>0.05),細菌(圖1-b)和霉菌(圖1-c)量不斷下降,遠小于自然發酵,而酵母菌量(圖1-a)在發酵初期明顯大于自然發酵(P<0.05),且始終高于自然發酵。對于自然發酵,與對照相比,添加洋蔥汁和SO2的發酵前期酵母菌量和細菌量增長較慢,霉菌量減少較快(P<0.05)；添加SO2的發酵前期酵母菌量增長比對照慢,比添加洋蔥汁快,而添加SO2始終比對照和添加洋蔥汁發酵的細菌量和霉菌量少(P<0.05)。

a-酵母菌；b-細菌；c-霉菌 C-自然發酵對照,S-自然發酵加SO2,O-自然發酵加洋蔥汁；C+-接種發酵對照,S+-接種發酵加SO2,O+-接種發酵加洋蔥汁(下同)圖1 紅葡萄酒發酵過程中菌群變化Fig.1 Changes of microflora during red wine fermentation

由圖1可見,接種酵母主導接種發酵過程,顯著抑制內源微生物生長,且遠大于添加SO2和添加洋蔥汁的抑制作用。內源釀酒酵母主導自然發酵過程,洋蔥汁和SO2均抑制內源微生物的早期生長,而SO2比洋蔥汁對內源細菌和霉菌的生長抑制更強,對內源酵母的生長抑制更弱。

在本研究葡萄酒釀造的生態環境下,加入洋蔥汁對內源酵母菌、細菌和霉菌表現出抑制作用,與洋蔥汁在其他應用環境的相關研究結果相似[13-18]。在葡萄酒釀造的生態環境下,添加膠體銀以及添加殼聚糖比添加SO2的酵母量小[5,10],與本研究結果相似。

2.2 不同處理方式下葡萄酒發酵過程的還原糖含量比較

在葡萄酒發酵過程中,還原糖因用于微生物生長、繁殖和代謝而減少。圖2顯示接種發酵明顯比自然發酵耗糖快；添加SO2和洋蔥汁均減緩耗糖(P<0.05)。與對照相比,添加洋蔥汁和SO2的接種發酵終點殘糖較高,添加洋蔥汁的自然發酵終點殘糖較高,而添加SO2的自然發酵終點殘糖較低(P<0.05)。

圖2 紅葡萄酒發酵過程中還原糖含量變化Fig.2 Changes of reducing sugar content during red wine fermentation

結果表明,接種酵母非常顯著地加快耗糖,遠大于添加洋蔥汁和SO2對耗糖的影響,添加SO2和洋蔥汁因抑制內源微生物生長而減慢耗糖,添加洋蔥汁因較強地抑制酵母生長而耗糖較慢較少。

2.3 不同處理方式下葡萄酒發酵過程的乙醇含量比較

由圖3可知,接種發酵比自然發酵生成乙醇較快。對自然發酵,添加洋蔥汁和添加SO2均抑制前期產乙醇,添加洋蔥汁的抑制作用更大(P<0.05)；添加洋蔥汁和添加SO2終點乙醇產量無顯著差異,但均比對照發酵的終點乙醇產量低(P<0.05)。對接種發酵,添加SO2抑制前期產乙醇；但不同處理發酵終點的乙醇產量無顯著差異(P>0.05)。雖然接種發酵比自然發酵過程中乙醇含量高,但接種發酵和自然發酵終點的乙醇產量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 紅葡萄酒發酵過程中乙醇含量變化Fig.3 Changes of ethanol content during red wine fermentation

可見,接種發酵速度較快,乙醇生成較快,但不影響乙醇總產量；添加洋蔥汁和添加SO2均抑制自然發酵產乙醇,且二者差異不顯著。SO2和黑蘿卜提取物在Carbernet Sauvignon和Mourvèdre紅葡萄酒發酵中的應用結果表現出前者比后者的乙醇產量高[6],與本研究的產乙醇結果不同,可能與添加劑的化學組成和用量有關,也與添加劑對微生物的作用效果有關。

2.4 不同處理方式下葡萄酒發酵過程的乙酸含量比較

由圖4可知,接種發酵比自然發酵產乙酸快,明顯降低乙酸終濃度(P<0.05)。對自然發酵,添加洋蔥汁和添加SO2均抑制發酵前期產乙酸,添加SO2的抑制作用更大；添加SO2比對照的發酵終點乙酸量低,而添加洋蔥汁比對照的發酵終點乙酸量高(P<0.05)。對接種發酵,添加洋蔥汁和添加SO2對發酵前期產乙酸也均有抑制(P<0.05)；添加SO2比對照的發酵終點乙酸量低(P<0.05),而添加洋蔥汁比對照的發酵終點乙酸量略高。

圖4 紅葡萄酒發酵過程中乙酸含量變化Fig.4 Changes of acetic acid content during red wine fermentation

可見,接種發酵能降低乙酸產量。添加洋蔥汁和添加SO2均抑制發酵初期產乙酸,添加洋蔥汁能提高乙酸產量,添加SO2能降低乙酸產量。

接種發酵速度較快,雖然乙酸生成較快速,但接種酵母及接種發酵的產物能有效抑制產醋酸的內源微生物的生長和代謝,從而使接種發酵比自然發酵的乙酸產量低。自然發酵比接種發酵的內源微生物多,但酵母總量較少,可能對產乙酸的微生物抑制作用較弱,使發酵后期的乙酸含量較高,雖然添加洋蔥和SO2都能抑制發酵前期產乙酸,但在發酵后期表現出添加洋蔥促進產乙酸,可能與洋蔥不抑制(或促進)產醋酸菌的生長與代謝有關[23]；而添加SO2仍然強烈抑制產乙酸,可推測SO2顯著抑制產乙酸微生物的生長與代謝,降低了自然發酵的產乙酸量,也同樣降低接種發酵乙酸產量。與HENICK-KLING[24]研究發現50 mg/L SO2對接種發酵產乙酸無影響的結果有別。本研究添加洋蔥的自然發酵和接種發酵終點的揮發酸[(0.57±0.08),(0.28±0.04)g/L]都與對照無顯著差異(P>0.05),添加SO2的自然發酵和接種發酵終點的揮發酸[(0.35±0.03),(0.25±0.03)g/L]卻明顯較低(P<0.05),與對乙酸的影響結果一致。SO2和黑蘿卜提取物在Carbernet Sauvignon和Mourvèdre紅葡萄酒發酵中的應用結果表現出前者比后者的乙酸產量低[4],與本研究的產乙酸結果相似。

2.5 不同處理方式下葡萄酒發酵過程的總酸和pH值比較

由圖5-a可知,接種發酵普遍比自然發酵終點總酸度高(P<0.05)。添加SO2和洋蔥汁會使總酸升高減慢(P<0.05),添加SO2作用更顯著,但添加洋蔥汁和添加SO2都會提高發酵終點總酸度(P<0.05)。接種發酵和自然發酵的pH值(圖5-b)變化趨勢相同,接種發酵始終比自然發酵的pH值低(P<0.05),而添加洋蔥和添加SO2對pH值的影響較小(變化在0.1以內,P>0.05)。

a-總酸；b-pH值圖5 紅葡萄酒發酵過程中總酸和pH值變化Fig.5 Changes in total acidity and pH value during red wine fermentation

葡萄酒的總酸度和pH值與其中的有機酸種類有關,對葡萄酒口感有重要影響。發酵初期,酸性較強的酒石酸、檸檬酸和蘋果酸等被微生物分解或利用較多[25],使pH值上升；隨著代謝生成的乳酸、醋酸和琥珀酸等有機酸量增加,pH值又逐漸降低；發酵后期的蘋果酸轉化成酸性較弱的乳酸以及酒石酸產生沉淀[26],使pH值升高。接種發酵產酸較多,pH值較低；自然發酵則相反。添加洋蔥汁和添加SO2可能促進了內源微生物代謝產酸。

2.6 不同處理方式下葡萄酒發酵過程的氧化還原電位比較

由圖6可知,接種發酵和自然發酵過程中的氧化還原電位均先降低后升高,接種發酵比自然發酵氧化還原電位變化更快,但2種發酵點的氧化還原電位差異不顯著(P>0.05)。與對照相比,添加洋蔥汁和SO2的整個發酵過程中的氧化還原電位均較低,降低幅度更大；添加SO2比添加洋蔥汁的最低氧化還原電位低(P<0.05)。

圖6 紅葡萄酒發酵過程中氧化還原電位變化Fig.6 Changes of redox potential during red wine fermentation

在葡萄酒發酵系統中添加洋蔥汁降低氧化還原電位可能是其中酚類化合物及多糖的還原作用[18]。在本研究的發酵前期,葡萄漿中的溶解氧被微生物的生長和代謝迅速消耗,又被產生的CO2進一步驅除,隨著發酵時間的延長和生成越來越多的乙醇,葡萄皮中具有還原性的花色苷逐漸浸漬到發酵漿,此外,發酵液中有較多的游離SO2,這些作用使氧化還原電位快速降低。當乙醇含量最大時氧化還原電位最低,說明乙醇是決定氧化還原電位的重要因素,其次是溶解氧和花青素濃度。在發酵后期,采樣操作把氧氣帶到發酵系統,浸出的花青素在一定程度上被氧化,SO2被氧化或與其他化合物相結合,以及隨著發酵的進行營養物質消耗和代謝產物生產,導致氧化還原電位上升到210～240 mV,低于初始氧還電位。與自然發酵相比,接種發酵的酵母數量更多,活性更高,代謝更強烈,氧化還原電位更早下降到最低。研究發現,在紅酒發酵過程中增加空氣控制氧化還原電位在高于自然水平的215 mV,能顯著增加酵母細胞生存能力和維持活細胞比率,加快葡萄酒發酵[27],這也解釋了本研究結果。此外,氧化還原電位最低出現的時間早于還原糖降至最低的時間,說明早期氧化還原電位下降主要因為溶解氧被大量消耗。氧化還原電位的最小值與最大發酵速率(即還原糖消耗速率)相吻合,這與KILLEEN等[27]的表述一致。高氧化還原電位可能導致葡萄酒具有陳化或氧化味。氧化還原電位的降低有利于香氣的形成。經具有還原性的SO2和洋蔥汁處理可有效降低葡萄酒氧化還原電位,從而保證葡萄酒的質量。添加洋蔥汁比添加SO2的自然發酵初期酵母生長量較少,耗糖較慢,可能耗氧也較少,使氧化還原電位較高。

2.7 不同處理方式下葡萄酒發酵過程的色度和褐變度比較

由圖7可知,接種發酵比自然發酵過程中的色度大(P<0.05),但2種發酵終點色度差異不顯著(P>0.05)。無論自然發酵還是接種發酵,與對照相比,添加SO2的發酵前期色度較低,而后期色度較高,而添加洋蔥汁的發酵過程色度始終較低(P<0.05)。添加洋蔥汁和SO2的接種發酵均比對照的終點褐變度低(0.80±0.03,0.55±0.04,0.78±0.01)；添加洋蔥汁和SO2的自然發酵均也比對照的終點褐變度低(0.74±0.03,0.52±0.11,0.71±0.01)。接種發酵比自然發酵褐變度高,添加洋蔥汁的褐變度最低,組間差異顯著(P<0.05)。

圖7 紅葡萄酒發酵過程中色度變化Fig.7 Changes of color intensity during red wine fermentation

影響葡萄酒色度的主要因素有花色苷的量和結構、pH值以及多酚化合物等[28-29]。發酵所產有機酸和醇類化合物會促進果皮中色素物質浸提到發酵液中,從而提高葡萄酒色度。添加洋蔥汁和SO2對微生物的抑制作用,使代謝產物生成較慢、較少,致使多酚、單寧以及花色苷浸出較慢、較少,使發酵前期色度較小。接種發酵代謝產物產生較快,多酚、丹寧以及花色苷浸出較快、較多,因此色度較高。添加洋蔥汁降低葡萄酒色度,而添加SO2提高葡萄酒色度,其原因還有待進一步研究。

葡萄酒褐變主要是酚類化合物(多酚、單寧和花色苷)氧化造成的。在葡萄酒發酵過程中,酚類化合物會被氧化,發生氧化聚合反應,產生深色物質,使葡萄酒顏色變暗[29-30]。接種發酵的氧化還原電位較高,所以褐變度較高。洋蔥汁和SO2均具有抗氧化作用,會抑制酚類化合物氧化,所以添加洋蔥汁和SO2的接種發酵和自然發酵褐變度都較低。添加洋蔥汁比添加SO2發酵的褐變度低,可能與添加洋蔥汁較強的抗氧化作用有關[19],其原因也有待進一步研究。

3 結論

接種的酵母對葡萄酒發酵環境中的細菌、霉菌和內源酵母均有抑制作用,其抑制作用明顯強于添加洋蔥汁和SO2。在葡萄酒發酵的生態環境中,添加50 g/L洋蔥汁和60 mg/L SO2均抑制內源微生物的早期生長,減慢耗糖,均抑制自然發酵產乙醇和發酵初期產乙酸,降低氧化還原電位和褐變度以及發酵初期的色度。添加SO2比添加洋蔥汁對內源細菌和霉菌的生長,氧化還原電位降低更多；添加洋蔥汁比添加SO2耗糖更慢,并提高乙酸產量,而添加SO2降低乙酸產量。在防褐變方面,添加洋蔥汁更有優勢；在提高色度和抗氧化性、抑菌、降低乙酸方面,添加SO2更有優勢。雖然添加洋蔥汁發酵初期具有辛辣刺激味,但隨著發酵的進行,洋蔥的刺激味逐漸減弱,可能是洋蔥中的蒜素類化合物逐漸被分解,發酵結束后,葡萄酒的洋蔥味十分微弱,而且表現出比添加SO2更圓潤的口感。所以,在葡萄酒釀造過程中,洋蔥汁有可能取代或部分取代SO2。本研究的洋蔥汁用量較大,對葡萄汁的稀釋作用較大,可考慮對洋蔥汁進行適當的低溫真空濃縮,或者用其他方法進行濃縮,對于洋蔥汁的具體用法以及作用機理還需要做進一步深入研究。