IL-17基因多態性與原發性膽汁性膽管炎易感相關性研究

譚為民，李佳，黃清水,王睿，周子聞，李彩嬌

（1.南昌大學第一附屬醫院檢驗科；2.南昌大學在校本科生科研訓練項目小組，江西 南昌 330006）

原發性膽汁性膽管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）原稱為原發性膽汁肝硬化（Primary biliary cirrhosis,PBC），是一種以中小膽管持續性非化膿性炎癥浸潤及膽汁淤積為主要特征的自身免疫病[1]。當前臨床對PBC尚無特效的治療方法，早期診斷及熊脫氧膽酸治療方案的應用可以明顯改善膽汁淤積癥狀及預后，但卻不能阻斷疾病進程，晚期唯一治療選擇是進行肝移植，嚴重危害患者的生命健康[2]。血清抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibodies，AMAs）陽性是PBC特異性血清診斷指標，AMAs主要靶抗原是線粒體自身抗原丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase E2 subunit，PDC-E2）[1，3]。該病患者以30歲以上中老年女性為主（男∶女約為1∶9）[4-5]，確切發病機制不清，可能與環境因素、遺傳因素、病毒和細菌感染、自身抗體、雌激素、免疫調控、趨化因子、抗原呈遞細胞、自噬、衰老、凋亡等有關，遺傳因素和炎癥因素是其重要發病因素[6-7]。

IL-17作為一類重要的炎癥因子家族，主要由Th17細胞分泌產生，在各類自身免疫病炎癥細胞聚集及浸潤中起關鍵作用。IL-17家族包括六個家族成員，分別為IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F[8]。IL-17A和IL-17F作為其中重要的炎癥因子，起著主要的炎癥作用[9]。研究表明，PBC組較健康對照組IL-17A表達顯著升高，與疾病嚴重程度成正相關[10]。IL-17多個SNPs突變位點與自身免疫病易感性相關，IL-17A G-197A(rs2275913)位點多態性被證明與類風濕關節炎易感性相關[11]，中東地區結直腸研究中，IL-17A rs2275913位點多態性與結直腸癌發病風險存在相關性，IL-17A rs2275913基因表達豐度能作為結直腸癌早期監測的基因信號[12]。一項關于亞洲人群胃癌風險與IL-17位點多態性研究顯示，IL-17A rs2275913和IL-17F rs763780兩個基因位點多態性與胃癌風險高度相關[13]。而關于IL-17相關SNPs位點基因突變和基因型是否與PBC易感性相關，尚未有學者進行相關研究。

IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025和IL-17F rs763780四個相關SNP位點是IL-17基因重要功能區位點。該研究擬在南昌大學第一附屬醫院PBC患者中分析IL-17 SNPs基因位點突變和基因型分布，在基因水平探討IL-17 SNPs位點多態性與PBC疾病易感相關性。明確PBC患者血清中IL-6、IL-12、IL-17細胞因子表達水平，分析其與健康對照組的表達差異。分析相關SNPs位點基因型與細胞因子表達間的關系，為PBC易感危險因素的診斷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 研究納入2018年1月至2020年6月南昌大學第一附屬醫院門診及住院就診的PBC患者，同時收集該醫院同時間段體檢科健康對照組全血和血清標本。本研究共納入56位PBC患者，60位健康人。由于PBC患者是零星出現的，主要采取“LIS系統查找-符合標準PBC患者全血和血清標本收集-患者信息錄入Excel表格-全血及血清標本凍存待用”的策略。匹配收集的PBC患者年齡和性別，收集相對應健康組全血及血清標本，兩周內完成收集。納入研究的PBC研究病例對象均經過臨床專業醫師的診斷，并且為初次診斷的患者。

依據2017年歐洲肝臟研究協會（European Association for the Study of the Liver,ESAL）中PBC的診斷標準[14]。PBC患者納入標準需符合以下三條標準中至少兩條：（1）抗線粒體抗體（AMAs）滴度大于1∶40[15]；（2）堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）或谷氨酰基轉移酶（Gamma-glutamyltransferase,GGT）濃度大于正常濃度上限的1.5倍，且持續時間大于24周；（3）典型的病理切片結果（如典型的中小膽管上皮細胞破壞或中小膽管炎癥浸潤情況）。

排除標準：（1）病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝癌；（2）近期患有嚴重傳染病和心血管疾病的；（3）接受免疫抑制藥物、增強藥物治療；（4）自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)、原發性硬化性膽管炎(Primary sclerosing cholangitis,PSC)與自身免疫性肝病重疊綜合征。

所有符合標準的PBC患者和健康組均按照規范采血要求進行操作?？鼓瞎苋獦吮痉盅b后做好標記，血清標本離心分離后分裝，均保存于-80℃的低溫科研冰箱中，避免對血液標本進行反復凍融。

1.2 DNA提取 嚴格按照北京天根生物技術有限公司的全血DNA提取試劑盒操作說明，提取PBC組和健康對照組抗凝全血中的DNA。提取的DNA的濃度和純度使用Quwell Q3000進行測定，OD 260/OD 280比值介于1.6～1.8符合標準，DNA標本保存于-20℃冰箱。

1.3 目的位點基因分型 相應的IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025 和 IL -17F rs763780位點SNPs由Sanger測序進行確定。為擴增出對應位點的目的DNA片段，Primer軟件設計四對引物，見表1，由上海生工進行合成。25μL PCR反應體系由5μL DNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，12.5μL GoTaq Green PCR mix混合液和3.5μL去核酸水組成。擴增條件：95℃變性5 min，每次95℃變性30 s進行35次循環，退火1 min，對應引物退火溫度見表1，72℃延伸90 s每循環，最后72℃延伸5 min，4℃冷藏。所有PCR擴增目的片段送到上海生工進行Sanger測序。

表1 對應位點引物及T m溫度

1.4 細胞因子和臨床指標測定 -80℃低溫冰箱保存的PBC組和健康對照組血清置于37℃溫箱進行解凍，融化混勻，離心去除雜質沉淀。流式細胞術測定兩組血清IL-6、IL-12、IL-17表達水平，嚴格按照細胞因子檢測試劑盒操作步驟進行。并同時收集兩組對應的血液和生化臨床指標，進行分析研究。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20軟件進行統計學分析，計量數據均以（±s）表示。F檢驗方差齊性，P＞0.05時，組間比較采用獨立樣本t檢驗，否則采用U檢驗。Haploview 4.2軟件用來分析哈溫平衡。線性相關分析采用Pearson相關性分析。分類數據采用Pearson卡方檢驗，單因素logistic回歸分析IL-17 SNPs與PBC易感相關性，以OR值和95%CI。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBC組和健康對照組臨床基本特征 56例PBC患者平均發病年齡為（56.25±14.59）歲，以中老年女性為主，男性患者14例，女性患者42例。匹配PBC患者年齡和性別收集健康人基本臨床信息，比較發現，PBC組的紅細胞（Red blood cell,RBC）、血 紅 蛋 白 （Hemoglobin,HGB）、血 小 板（Platelets,PLT）及血細胞比容（Hematocrit,HCT）數值顯著低于健康對照組，差異具有統計學意義。生化指標方面，總蛋白（Total protein,TP）、白蛋白（Albumin,ALB）、A/G指標PBC組顯著低于健康對照組，而丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、A/G指標PBC組顯著高于健康對照組，尤其是生化指標中反應膽汁淤積情況的指標谷氨酰基轉移酶（Gamma-glutamyltransferase,GGT）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、總膽紅素（Total bilirubin,TBIL）、直接膽紅素（Direct bilirubin,DBIL），PBC顯著高于健康對照組。ALP指標PBC組是健康組的3.2倍，GGT指標PBC組是健康組的5.5倍，TBIL指標PBC組是健康組的3.3倍，DBIL指標PBC組是健康組的12.9倍，PBC組均遠高于健康對照組，見表2。

表2 PBC組與健康對照組基本臨床特征

2.2 PBC組和健康對照組IL-17 SNPs位點突變和基因型分析 PBC組和健康對照組IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025 和 IL -17F rs763780四個SNPs位點基因型進行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)基因平衡分析，兩組四個SNPs基因型P＞0.05時，分布符合哈-溫平衡，具有研究意義，見表3。

表3 PBC組和健康對照組哈迪-溫伯格平衡檢驗結果

對兩組四個SNPs位點基因型和基因頻率進行顯性模型、隱性模型、共顯性模型分析。IL-17A rs10484879和IL-17F rs763780基因位點三種基因型模型中，PBC組和健康對照組表達差異均無統計學意義。IL-17A rs2275913位點隱性模型和共顯性模型中，PBC組基因型AA表達少于健康人群中AA表達，差異有統計學意義。隱性模型中，AA基因型OR值和95%CI分別為0.383，（0.157～0.935）；共顯性模型中，AA基因型OR值和95%CI分別為0.330，（0.109～0.998）。IL-17A rs3819025位點顯性模型和共顯性模型中，PBC患者GA和AA基因型遠多于健康人這兩種基因型表達，GG基因型表達少于健康人表達，差異具有統計學意義。顯性模型中，GA+AA基因型組合OR值和95%CI分別為11.600，（2.527～53.259）；共顯性模型中，GA基因型OR值和95%CI分別為10.150，（2.186～47.127）。PBC組和健康組突變位點基因型和等位基因表達和頻率，見表4。

表4 PBC組和健康對照組基因型和基因頻率分析結果

2.3 PBC組和健康對照組細胞因子表達水平 分析兩組血清中IL-6、IL-12、IL-17A表達水平，PBC組均顯著高于健康對照組，見表5。通過Pearson相關性分析發現，PBC組中IL-17A表達與IL-6表達成正相關（r=0.4818,P=0.0003）,圖1，也與IL-12表達成正相關（r=0.3714,P=0.0048）,圖2。IL-6表達水平未發現與IL-12表達水平存在相關性（P＞0.05）。

圖1 PBC組IL-17A與IL-6表達相關性

圖2 PBC組IL-17A與IL-12表達相關性

表5 PBC組和健康組細胞因子表達水平

2.4 PBC組IL-17A rs3819025位點不同基因型細胞因子及生化指標表達 分析IL-17A rs3819025位點不同基因型細胞因子及生化指標表達差異，見表6。反應膽汁淤積指標TBIL、DBIL、ALP、GGT，AA+GA基因型人群均高于GG型人群。IL-17A表達水平AA+GA基因型人群也高于GG型人群。IL-6、IL-12表達水平AA+GA基因型人群低于GG型人群，但所有差異不存在統計學意義。

表6 PBC組細胞因子及生化指標不同基因型表達

3 討論

收集2018年1月至2020年6月南昌大學第一附屬醫院確診PBC患者56例納入研究，并匹配其年齡和性別收集60例健康對照組。分析可知，江西PBC患者以中年女性為主，平均患者年齡（56.25±14.59）歲，男女比例為1∶3。近幾年流行病學調查顯示，隨著醫療水平提高PBC確診率的提高，PBC患者男女比例有所增加，甚至有調查PBC患者男女比例為1∶2.1[16]，這與該研究分析結果較為符合。比較兩組肝生化指標，PBC較健康對照組ALT、AST指標顯著升高，ALT約為對照組4倍，AST約為對照組5倍。慢性肝炎尤其是肝纖維化時，AST升高程度高于ALT升高程度[17]。PBC患者肝損傷為慢性肝炎，且可能進展為肝纖維化。PBC患者易出現黃疸、瘙癢、疲憊等并發癥。比較兩組DBIL、IBIL和TBIL指標，PBC組三項指標均顯著升高，以DBIL升高尤甚，約為健康對照組的16倍，IBIL約為健康組2倍，PBC患者以膽汁淤積梗阻性黃疸為主。PBC組ALP指標約為健康對照組4倍，PBC組GGT指標約為健康對照組7倍。ALP高于正常值上限1.5倍，是確診PBC的條件之一[14]。ALP升高不僅僅出現在膽汁淤積性肝病中，還有諸多生理性或病理性原因可引起ALP升高[18]（如骨骼性疾病，青少年生長期，婦女妊娠期等）。臨床上通常結合GGT指標和DBIL判斷患者膽汁淤積情況，并結合AMAs陽性用于確診PBC[19]。綜上所述，PBC患者中小膽管的損傷，造成患者出現以DBIL升高為主，IBIL輕微升高為特征的膽汁淤積性黃疸，引起ALP、GGT指標升高，導致肝臟的慢性炎癥損傷，肝臟蛋白合成能力受損，白蛋白合成下降，持續存在的肝臟炎癥可能引起肝臟纖維化。患者體內免疫系統激活，相應IgG和IgM抗體合成增加，GLB升高明顯。

PBC作為一種復雜的自身免疫病，盡管其發病機制尚未闡明，但我們已經認識到遺傳因素、免疫因素和炎癥因素在PBC發病中起重要作用[20]。作為關鍵的促炎因子之一，IL-17A相關SNPs在多種自身免疫病研究中已被證明與疾病易感性存在相關性，但結果各異[21-22]。IL-17A位于人染色體6q21，由3個外顯子和2個內含子構成[23]，有關IL-17A基因位點多態性與PBC易感相關性分析鮮有研究。本研究分析IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025和IL-17F rs763780四個SNPs位點與PBC易感相關性。首先對兩組四個SNPs位點基因型分布進行哈-溫平衡檢測，其分布頻率均符合哈-溫平衡，說明兩組基因均無群體偏差，具有人群代表性。PBC組和健康組中，rs10484879和rs763780 SNPs位點基因突變和基因型分布差異無統計學差異，這兩個SNPs位點基因突變與PBC易感性不存在相關性。

IL-17A rs2275913 SNPs位點中野生型等位基因為G，A為其突變型等位基因。在隱性模型和共顯性模型中，PBC組AA基因型攜帶者均少于健康對照組AA攜帶者。隱性模型中，GA和GG基因型攜帶者PBC易感性是AA基因型攜帶者的2.61倍；共顯性模型中，GG基因型攜帶者PBC易感性是AA基因型攜帶者的3.03倍。提示AA基因型攜帶者PBC易感性降低，AA基因型可能是PBC保護基因型。IL-17A rs2275913位點突變型A等位基因可能為PBC保護因素。

IL-17A rs3819025 SNPs位點，PBC患者突變型基因位點A顯著多于健康對照組。顯性模型中，PBC組GA+AA基因型頻率顯著高于健康對照組中出現頻率，GA+AA基因型攜帶者PBC易感性是GG基因型攜帶者的11.60倍；共顯性模型中，GA基因型攜帶者PBC易感性是GG基因型攜帶者的10.15倍。提示rs3819025 SNPs位點A等位基因突變，會增加PBC疾病易感性，GA和AA基因攜帶者具有更高的PBC患病風險。IL-17A rs3819025 SNPs位點突變型A等位基因會顯著增加PBC易感性，是PBC危險因素。

分析rs3819025 SNPs位點不同基因型生化指標，AA+GA基因型ALP、GGT、TBIL、DBIL指標較GG基因型表達水平升高，提示A突變有可能與PBC中膽汁淤積有關。分析rs3819025 SNPs位點不同基因型細胞因子表達，GA+GA基因型較GG基因型IL-17表達水平升高，提示IL-17A rs3819025位點突變有可能會增強IL-17相關基因轉錄活性，進而促進IL-17表達，并進一步引起其他多種細胞因子表達差異。而相關作用機制需要后續研究進一步探索?？偠灾?，IL-17A rs2275913和rs3819025 SNPs位點多態性與PBC易感性相關。rs2275913位點AA基因型攜帶者PBC易感性較低，rs3819025位點GA和AA基因型攜帶者易發生PBC。IL-17 SNPs多態性可能作為預防診斷PBC的候選基因，從而為PBC早期診斷和預防提供相應依據。

比較兩組炎癥細胞因子IL-6、IL-12和IL-17A表達水平，PBC組三者表達均高于健康對照組。分析可知，PBC中IL-17A的表達與IL-6和IL-12的表達成正相關，炎癥因子在PBC病情進展相互影響，影響各自的分泌產生。分析PBC組rs3819025 SNPs位點不同基因型對細胞因子和生化指標的影響，GA+AA突變型基因型較GG野生型基因型IL-17表達水平升高，相關膽汁淤積和肝損傷指標表達也有所升高。但由于可能納入研究標本量較少，所有差異均不存在統計學意義，需后續研究擴大樣本量驗證。

該研究提示，IL-17A rs2275913和rs3819025 SNPs位點多態性可能與PBC易感性相關。rs2275913位點AA基因型攜帶者PBC易感性較低，是PBC發病保護因素；rs3819025位點GA和AA基因型攜帶者易發生PBC，是PBC發病危險因素。IL-17 SNPs多態性研究可為PBC早期診斷和預防提供預測依據。