批分析（多管同測）法超敏檢測低濃度乙型肝炎病毒核酸

斯志娟，雷震

（南昌大學(xué)附屬感染病醫(yī)院 南昌市第九醫(yī)院，江西 南昌 330002）

人類非自限性病毒感染性疾病的病因?qū)W治療手段有限，目前，大多依賴核苷（酸）類似物破壞病毒（逆）轉(zhuǎn)錄，干擾或終止病毒核酸的合成，達到抗病毒的作用。如HBV[1]、HCV[2]、HIV[3]等。核苷（酸）類似物不能清除病毒，但可通過長期抑制病毒復(fù)制，耗盡病毒庫的方式，達到清除病毒的目的。核苷（酸）類似物治療的理想停藥時機是體內(nèi)病毒庫被耗盡，這就促使臨床對核酸檢測靈敏度無限高的期望（檢測下限無限地接近于0）[4]。有研究證實[5]，抗HBc陽性的隱匿性HBV感染的獻血者血液中含有0.15 IU/mL的HBV DNA，即可導(dǎo)致受血者感染。當(dāng)前臨床檢測技術(shù)采用磁珠法富集核酸[6-7]，以提高原始樣本擴增量。數(shù)字PCR技術(shù)[8]采用流體芯片或微滴技術(shù)等方式分配成單拷貝靶核酸擴增，通過計數(shù)陽性孔數(shù)目的方式進行核酸絕對定量檢測。我們采用批分析（多管同測）法對低濃度（載量）樣本進行核酸擴增檢測，以期建立一種新的低濃度（載量）核酸檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 我院就診患者HBV DNA檢測后剩余血清約1.5 mL，檢測結(jié)果約2×103IU/mL。

1.2 儀器功與試劑 SlAN-96S全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量PCR檢測試劑（批號：2021019，圣湘生物科技股份有限公司）；核酸釋放劑（批號：2021019，圣湘生物科技股份有限公司）；細胞保存液（批號：12021003，圣湘生物科技股份有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 將上述樣本分裝在離心管中-20±5℃冷凍保存，每管130μL。

1.3.2 梯度濃度樣本盤的選擇 取一份樣品用細胞保存液稀釋成1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000的梯度濃度樣本，用乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量PCR檢測試劑擴增檢測上述梯度濃度樣本，各平行檢測3管。

取三管均陽性的最低濃度（1∶100）樣本，再用細胞保存液稀釋成1∶100、1∶200、1:400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600的梯度濃度樣本，然后用乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量PCR檢測試劑擴增檢測該梯度濃度樣本，各平行檢測10管，選擇全部陽性的最低濃度樣本為S1（1∶200）、然后依次S2（1∶400）、S3（1∶800）、S4（1∶1 600）、S5（1∶3 200）、S6（1∶6 400）、S7（1∶12 800）形成梯度濃度樣本盤。

1.3.3 梯度濃度樣本盤的檢測 用乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量PCR檢測試劑檢測上述梯度濃度樣本盤S1～S7，每批各樣本平行測10管，每天檢測4～6批，共計檢測20批次。

每一批次設(shè)定量參考品4個（A：4×107IU/mL、B：4×106IU/mL、C：4×105IU/mL、D：4×104IU/mL）、陽性對照和陰性對照各1個。

1.3.4 質(zhì)量控制 （1）乙型肝炎病毒（HBV）陰性對照：無Ct值顯示；但乙型肝炎病毒（HBV）-內(nèi)標(biāo)檢測為陽性（Ct≤40）；（2）乙型肝炎病毒（HBV）陽性對照：檢測濃度介于1.26×105-1.26×106IU/mL；（3）四個乙型肝炎病毒（HBV）定量參考品均檢測為陽性，且標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)|r|≥0.98；（4）以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本批次實驗無效。

1.3.5 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) 檢測到典型的S型擴增曲線，且Ct≤40，判斷為陽性。

1.3.6 批分析陽性與批分析陰性 批分析陽性，批分析中至少有一管陽性即該批分析陽性。批分析陰性，批分析中無陽性管即該批分析陰性。

1.3.7 1copy/管Ct變異區(qū)間確定 上述實驗中，選擇所有批次檢測中無Ct值檢測管＞20%的各濃度水平陽性管Ct集合，按偏態(tài)分布90%CI確定為1copy/管Ct變異區(qū)間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用永中Excel進行數(shù)據(jù)及圖表處理。計數(shù)資料采用百分率，計量資料采用（±s），精密度采用CV。1copy/管Ct分布區(qū)間的確定采用偏態(tài)分布90%CI。

2 結(jié)果

2.1 乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量PCR檢測試劑基本信息 乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量PCR檢測試劑擴增循環(huán)參數(shù)，見表1。樣本釋放劑5μL加樣本5μL,用移液器吸打3～5次混勻，靜置10 min后，加入PCR混合液（乙型肝炎病毒核酸PCR反應(yīng)液38μL加酶混合液2μL加內(nèi)標(biāo)0.2 μL）上機擴增。檢測通道FAM；內(nèi)標(biāo)通道VIC；參比通道ROX。

表1 乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量PCR檢測試劑擴增循環(huán)參數(shù)

2.2 質(zhì)量控制 各檢測批次陰性對照均陰性且內(nèi)標(biāo)為陽性（Ct＜40），陽性對照結(jié)果1.4244～4.5304×105IU/mL，四個乙型肝炎病毒（HBV）定量參考品均檢測為陽性，且標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)|r|=0.99684～1。陽性對照、定量參考品測定管Ct統(tǒng)計，見表2。

表2 陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)品C t統(tǒng)計

2.3 1copy/管Ct分布區(qū)間確定 所有批次檢測中無Ct值檢測管＞20%的各濃度水平（S3～S7）陽性管Ct集合，見圖1。以S3～S7陽性管Ct集合為樣本，按偏態(tài)分布90%CI確定的1copy/管Ct變異區(qū)間為38.24～40。

圖1 所有批次檢測中無Ct值檢測管＞20%的各濃度水平（S3～S7）陽性管C t集合(升序折線圖）

2.4 各濃度各批次陽性測定管數(shù)統(tǒng)計 S1～S7單管檢測陽性檢出率分別為：92%、71%、35%、25.5%、12%、6%、4.5%，批分析陽性檢出率分別為：100%、100%、85%、90%、60%、40%、40%。見表3。

表3 各濃度各批次陽性測定管數(shù)統(tǒng)計

3 討論

本研究中，1 copy/管Ct變異區(qū)間指的是每支擴增管中只有1 copy靶核酸時擴增的Ct變異分布范圍。此時的Ct變異不表示進入擴增管靶核酸的多寡，而是表達核酸擴增及擴增效率的隨機性。因此，在臨床檢測中，當(dāng)Ct處于1 copy/管Ct變異區(qū)間時，不應(yīng)用常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，而應(yīng)當(dāng)以1copy/管的方法定量，此方法與數(shù)字PCR類似[9]。影響核酸擴增效率的因素較多，包括試劑因素、靶核酸因素及儀器因素等。因此，建議1 copy/管Ct變異區(qū)間應(yīng)由各臨床實驗室實驗確定。

在確定1 copy/管Ct變異區(qū)間時，應(yīng)盡量避免或減少將非1 copy/管Ct變異區(qū)間的Ct納入。為此，本研究采用了兩種措施（1）以所有批次檢測中無Ct值檢測管＞20%的各濃度水平陽性管Ct集合為樣本，（2）選用偏態(tài)分布90%CI。本研究顯示，選擇S3～S7陽性管Ct集合為樣本的1 copy/管Ct變異區(qū)間為38.24～40。

本研究用常規(guī)的方法檢測低濃度（載量）核酸樣本，當(dāng)樣本濃度低于試劑檢測下限時，采用單管檢測可能不是每一次都有靶核酸進入擴增體系，若采用批分析（多管同測）法，每增加一管，被檢測的樣本總量都相應(yīng)的增加，靶核酸被檢出的概率也就相應(yīng)地增加。結(jié)果顯示，本研究S1～S7單管檢測陽性檢出率分別為：92%、71%、35%、25.5%、12%、6%、4.5%，批分析陽性檢出率分別為：100%、100%、85%、90%、60%、40%、40%。

低濃度（載量）核酸樣本，采用批分析（多管同測）法檢測，在不改變單管擴增體系環(huán)境的條件下，增加了實際擴增分析的樣本總體積，從而提高了分析的靈敏度，具有更高的陽性檢出率。批分析檢測管數(shù)的選擇可根據(jù)實際需求個性化確定。現(xiàn)有的超敏核酸檢測場景，多采用富集核酸的技術(shù)制備核酸模板，需要使用專用設(shè)備及試劑。本研究方法采用常規(guī)核酸檢測試劑，無需專用設(shè)備，可提高基層檢測單位的超敏檢測需求的可及性。在已有超敏核酸檢測場景的實驗室，在此基礎(chǔ)上，采用該多管同測擴增檢測的技術(shù)可達到更高的靈敏度。在有超敏檢測需求的患者，如核苷（酸）類似物治療終點選擇時可以采用該研究方法，為治療終點抉擇提供更為靈敏的參數(shù)支持。該研究方法主要用于臨床低濃度（載量）核酸樣本檢測，樣本無需稀釋，只要同時檢測多管。

本研究中，所有批次檢測中，標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)系數(shù)|r|在0.99684～1之間波動，單個測定點Ct的CV小于1%，陽性對照Ct的CV小于1%，陰性對照均陰性，表明在常規(guī)檢測濃度區(qū)域（中、高濃度區(qū)域），試劑性能穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性好，與相關(guān)研究一致[10]。在該濃度區(qū)域，單管檢測能滿足臨床需求，無需多管檢測。

綜上所述，實驗室應(yīng)實驗確定各核酸定量項目的1 copy/管Ct變異區(qū)間；當(dāng)Ct處于1 copy/管Ct變異區(qū)間時，不應(yīng)用常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，而應(yīng)當(dāng)以1copy/管的方法定量；采用批分析（多管同測）法檢測低濃度（載量）核酸樣本可提高陽性檢出率。當(dāng)然，該方法還需要在大量的臨床檢測中驗證。另外，批分析（多管同測）法是一種樣本處理方法，廣泛適用于核酸擴增檢測的諸多領(lǐng)域，其在丙型肝炎病毒核酸檢測、人類免疫缺陷病毒核酸檢測、循環(huán)核酸腫瘤標(biāo)志物檢測等有超敏檢測需求的各領(lǐng)域，也有待于廣泛的臨床檢測驗證。