肺血管炎外周血miRNA表達水平及其臨床意義

劉賢，陳強倫，馮勝東

（1.河南省信陽市中醫(yī)院肺病科，河南 信陽 464000；2.河南省鄭州市第七人民醫(yī)院心內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

肺血管炎是全身性、系統(tǒng)性壞死性血管炎累及肺臟血管的一組疾病，在我國并不少見，多發(fā)于中老年人群[1]。肺血管炎屬于風濕免疫類疾患，具有起病隱匿，多臟器受累的特點，臨床表現(xiàn)復雜多樣、缺乏特異性，主要表現(xiàn)為肺部炎性反應和伴有不同程度肺外臟器損害，肺科醫(yī)生若不熟悉此病特點極易引起誤診和漏診，影響肺血管炎的治療和預后[2]。因此，早期診斷與鑒別肺血管炎就顯得尤為重要。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是機體代謝分子群中新近發(fā)現(xiàn)的生物活性RNA分子，存在于人類外周血中，能夠與血漿中多種分子相結(jié)合，通過多種分泌方式參與呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)障礙、自身免疫性疾病等多個系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[3]。miRNA在不同疾病人群的血漿表達水平不同，并且能在血清和血漿中持續(xù)且穩(wěn)定的表達，故可作為疾病的生物學標志物[4]。目前對于miRNA在肺血管炎中表達的相關(guān)研究鮮有文獻報道，因此，本研究分析了肺血管炎患者外周血中miRNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a的表達水平及其臨床意義，以期為臨床肺血管炎的診斷提供一些理論參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月至2019年3月期間我院收治住院的86例抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）相關(guān)性肺血管炎患者作為研究對象，納入研究組，對其臨床資料和組織血清標本進行回顧性分析。86例患者中男性52例，女性34例；年齡29～75歲，平均年齡（51.46±5.23）歲；病程（2.59±0.35）年；其中顯微鏡下多血管炎（MPA）79例，肉芽腫性血管炎（GPA）7例。納入標準：（1）所有患者符合ANCA相關(guān)性肺血管炎的診斷標準[5]，以及其中MPA和GPA的分類標準，并經(jīng)電子計算機斷層掃描（Computed tomography,CT）、肺活檢確診為肺血管炎；（2）均以發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咳血、胸痛和不同程度呼吸困難為主要表現(xiàn)者；（3）ANCA檢測為陽性者；（4）具備血清標本和完整的臨床資料者。排除標準：（1）發(fā)病前已確診有上呼吸道感染或肺部感染或其他肺部疾病患者；（2）合并惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病者。另選取于我院行健康體檢的人群80例作為正常對照組，均具備血清標本和完整的臨床資料者。排除標準：（1）合并嚴重肝腎功能障礙、惡性腫瘤者；（2）全身免疫性疾病者；（3）嚴重心腦血管疾病者。對照組中男性39例，女性41例，年齡27～76歲，平均年齡（52.26±5.77）歲，兩組性別、年齡比較無明顯差異（P＞0.05），具有可比性。本研究在獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準后進行。所有患者血清標本均取自患者的外周血，并經(jīng)10 000 r/min高速離心后取上清液置于液氮中保存。

1.2 實驗室指標檢測 統(tǒng)計患者入院時血清檢查指標，包括血清C反應蛋白（C-reactive protein,CRP）、紅細胞沉降率（Erythrocyte sedimentation rata,ESR）、肌酐值和血常規(guī)指標等。其中CRP采用酶聯(lián)免疫法進行檢測，ESR采用魏氏法自動血沉測定儀測定，肌酐值和血常規(guī)采用日立7100型全自動生化分析儀進行檢測。

1.3 miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a的檢測 采用實時定量-PCR方法進行miRNA的檢測，主要操作方法為：取兩組患者凍存的血清標本，采用RNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒按規(guī)定步驟提取血清中游離總RNA，即刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于擴增。選RUN6為內(nèi)參照，其中miRNA-155引物序列：5” -CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CCCCTAT-3” 。mi RNA-125b引物序列上游：5” -ACACTCCAGCTG GGTTAATGCTAATTGTGAT-3” ，下 游：5” -TGGTGTCGTGGAGTCG-3” 。mi RNA-125b：PCR引物序列 上 游：5” -UCCCUGAGACCCUAPCUUGUGA-3” ，下 游：5” -ACAPGUUAGGGUCUCAGGGAUU-3” 。mi RNA-146a：正相引物序列為：ACACTCCAGCTG GGT-GAGAACTGAATTCCATGGGT，反相引物序列為：CT-CAACTGGTGTCGTGGA。經(jīng)過35個循環(huán)擴增后，根據(jù)Ct值分析出miRNA相對表達量，繪制熔解曲線，根據(jù)熔解曲線判斷PCR產(chǎn)物的特異度。使用2-ΔΔCT法計算各組miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，本研究中涉及的計數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗；計量資料采用“Mean±SD”表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多因素分析采用Logistic回歸模型；通過ROC曲線分析mi RNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a對肺血管炎的診斷價值；對符合正態(tài)分布的兩數(shù)據(jù)采用Pearson進行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清中mi RNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a表達水平比較 經(jīng)半定量RT-PCR檢測后，研究組血清miRNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a表達量明顯高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清中miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a表達水平比較

2.2 發(fā)生肺血管炎的單因素分析 兩組患者有無進行性貧血、肌酐值、服用PTU藥物史比較無顯著性差異（P＞0.05），兩組患者在年齡、肺部感染史、CRP、ESR、mi RNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a方面存在明顯差異（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者肺血管炎的單因素分析

2.3 兩組患者肺血管炎的多因素Logisitic回歸分析 以是否發(fā)生肺血管炎作為因變量，將單因素中差異存在統(tǒng)計學意義的因素（年齡、CRP值、ESR值、肺部感染史、血清mi RNA-155表達、血清miRNA-125b表達、血清miRNA-146a表達）作為自變量，并進行賦值，年齡（<50歲=0，≥50歲=1）肺部感染史（無=0，有=1）、血清CRP值（<10 mg/L=0，≥10 mg/L=1）、ESR（<27 mm/1h=0，≥27 mm/1h=1）、血清mi RNA-155表達（<0.7=0，≥0.7=1）、血清mi RNA-125b表達（<2=0，≥2=1）、血清miRNA-146a表達（<1=0，≥1=1），并將其納入Logisitic回歸模型中，結(jié)果顯示血清miRNA-155表達≥0.7、血清miRNA-125b表達≥2和血清miRNA-146a表達≥1是患者發(fā)生肺血管炎的獨立預測因素，見表3。

表3 影響肺血管炎的多因素Logisitic回歸分析

2.4 單項指標診斷與聯(lián)合診斷的ROC曲線分析ROC曲線顯示血清中miRNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a表達水平單獨診斷肺血管炎的ROC曲線下面積分別為0.735、0.681和0.740，聯(lián)合診斷肺血管炎的ROC曲線下面積為0.867。血清中miRNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a表達水平聯(lián)合診斷肺血管炎的ROC曲線下面積顯著高于miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a的單項診斷，差異性顯著（P＜0.05）；且血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a水平單獨診斷肺血管炎時，三個指標的截斷值分別為：0.736、2.256和1.148，見表4，圖1。

圖1 血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a單項診斷與聯(lián)合診斷ROC曲線

表4 各種檢測方法的ROC曲線AUC值

2.5 血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a水平的相關(guān)性分析 將血清miRNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a數(shù)據(jù)進行Pearson相關(guān)性分析，得出miRNA-155與miRNA-125b的兩數(shù)據(jù)呈顯著正相關(guān)性（r=0.246，P=0.013）；miRNA-125b與mi RNA-146a的兩數(shù)據(jù)呈顯著正相關(guān)性（r=0.316，P=0.025）；miRNA-155與miRNA-146a的兩數(shù)據(jù)呈顯著正相關(guān)性（r=0.31，P=0.014）。

3 討論

肺血管炎是系統(tǒng)性小血管炎侵潤肺部最常見疾病，部分患者繼發(fā)于肺部感染或肺以外的慢性腎炎、風濕性關(guān)節(jié)炎等病，常累及腎臟導致腎功能異常，但在早期時癥狀不明顯，后期癥狀表現(xiàn)亦不典型，導致早期診斷較為困難[6-7]。肺血管炎患者早期實驗室指標檢查常出現(xiàn)ASR明顯增加、CRP升高，但無特異性，特異性指標抗中性粒細胞胞漿抗體檢測在早期也可能呈陰性表達，其陰性率可達30%，極易導致患者被誤診和漏診[8]。因而，積極尋求更為有效且準確的肺血管炎檢測指標對于其早期診斷、治療和預后具有重要的臨床意義。已有研究表明miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a等miRNA分子能參與機體免疫、內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，并且在血漿中呈持續(xù)、穩(wěn)定的表達，可作為多種疾病的生物學標志物[9]。

本研究通過半定量RT-PCR法檢測得出研究組血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a 表達量明顯高于對照組，肺血管炎的單因素分析結(jié)果顯示，兩組患者在年齡、肺部感染史、CRP、ESR、miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a方面存在明顯差異；多因素分析結(jié)果顯示，血清mi RNA-155表達≥0.7、血清miRNA-125b表達≥2和血清mi RNA-146a表達≥1是診斷患者發(fā)生肺血管炎的獨立預測因素。以上結(jié)果表明，miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a在肺血管炎患者血清中呈高表達，并且三者在血清中的高表達與肺血管炎發(fā)生的具有重要聯(lián)系。肺血管炎患者既往出現(xiàn)肺部感染可能造成機體免疫功能下降，肺部血管易遭受病原菌感染而引發(fā)血管炎癥反應，肺部出現(xiàn)感染患者若不及時治療，病情嚴重時極可能引發(fā)肺血管炎，并出現(xiàn)與之類似的發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀[10]。同時，當患者機體出現(xiàn)CRP≥10 mg/L、ESR≥27 mm/1 h時，常提示患者的炎癥急性相反應，此時結(jié)合患者早期呼吸道癥狀，可初步認為患者有發(fā)生肺血管炎的可能。CRP和ESR均是目前臨床上的常用炎癥指標。對于mi RNA分子參與肺血管炎的反應機制，有研究表明，肺血管炎的本質(zhì)是多種炎癥細胞參與調(diào)節(jié)的血管炎癥反應，其炎癥反應細胞包括中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸細胞、單核細胞、巨噬細胞等多種成分混合出現(xiàn)[11]。這些炎癥反應細胞能分泌多種具有組織損傷性的蛋白顆粒，引起炎癥反應，是反映全身免疫狀態(tài)的重要監(jiān)測指標，其在肺部血管的聚集和浸潤還可進一步導致血管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[12]。mi RNA-155是被證實對T細胞功能相關(guān)的基因表達和炎癥反應發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用的miRNA分子，參與T細胞、B細胞和巨噬細胞的發(fā)育、分化、活化、增殖及其穩(wěn)態(tài)的維持，其在肺血管炎患者血清中呈現(xiàn)高表達其機制目前尚不明確，考慮與mi RNA-155參與淋巴細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的形成有關(guān)[13]。miRNA-125b在肺血管炎患者血清中的高表達考慮與其抑制了抑癌基因P53的表達有關(guān)[14]。人體抑癌基因p53參與了嗜酸性粒細胞的凋亡過程，而MiRNA-125b被證實可抑制p53mRNA的表達并對其進行負向調(diào)控抑制細胞凋亡的發(fā)生。MiRNA-125b高表達時通過抑制p53基因的表達減少了嗜酸性粒細胞的凋亡，促進了患者的肺部血管炎癥反應[15]。實驗證明，miRNA-146a的表達受核因子kB直接調(diào)控，同時可以mi RNA-146a標靶白介素1受體下游的信號因子[16]。肺血管炎患者機體較強的炎癥反應，使免疫細胞中核因子kB的活性增強，進而調(diào)控mi RNA-146a在血清中呈現(xiàn)高表達水平[17]。因此，血清中mi RNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a三種分子的表達量與肺血管炎的發(fā)生均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，這與本研究的相關(guān)性分析結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，血清miRNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a表達水平聯(lián)合診斷肺血管炎的ROC曲線下面積顯著高于三者單獨診斷時的ROC曲線下面積，表明血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a表達水平聯(lián)合檢測肺血管炎的價值更高，可作為肺血管炎診斷的新指標，具有較好的應用價值。然而本研究仍有局限性，本研究為回顧性分析，且年齡亞組分析兩組不匹配，故難免存在偏倚；另外本研究為單中心研究，樣本量較少，因此未來尚需擴大樣本量，開展多中心研究。

綜上所述，mi RNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a在肺血管炎血清中呈高表達，并互為正相關(guān)性，血清三項指標聯(lián)合檢測對于臨床上預測與診斷肺血管炎具有較好的應用價值。因而臨床上可通過聯(lián)合檢測患者血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a水平以篩選肺血管炎的高風險人群，并進行預測和診斷肺血管炎的發(fā)生，盡早采取治療措施，防止病情惡化。