陰道脫落細胞中PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的相關性分析

豆中敏，李紫陽

（1.周口市第一人民醫院婦科，河南 周口 466700；2.周口市第一人民醫院普外科，河南 周口 466700）

宮頸癌是發生在宮頸部位的一種惡性腫瘤，多發生與中老年女性[1]。高危型人乳狀瘤病毒（HRHPV）持的主要原因[2]。從HR-HPV持續感染到癌前病變，再到宮頸癌的發生是一個較長的過程，定期篩查和注射疫苗有助于早期預防宮頸癌的發生[3]。因此早期診斷、盡早治療續感染是導致宮頸癌發生有助于提高治療效果，改善預后[4]。陰道局部環境內的免疫性細胞因子在宮頸病變發病機制中發揮的作用受到了越來越廣泛的重視[5]。程序性死亡分子1(PD-1)、程序性死亡配體1(PD-L1)、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)在機體的免疫應答與炎癥反應中起重要作用，有研究報道其在肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤疾病中有表達，并與腫瘤預后有關[6]。在以往的研究中關于PD-1、PD-L1、MIF水平與HR-HPV感染及宮頸癌病變程度均有報道，但關于三者聯合檢測的報道較少，本研究以不同宮頸病變患者為研究對象，檢測不同宮頸病變患者陰道分泌液中PD-1、PD-L1、MIF表達水平，探討陰道局部微環境中PD-1、PD-L1、MIF水平的變化與HR-HPV感染及宮頸病變程度的關系，為臨床宮頸癌的早期診斷與預防提供新的思路與參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續收集2017年1月至2020年3月到本院婦科門診進行宮頸癌篩查結果中宮頸HR-HPV陽性的150例患者為研究對象，對其進行HPV分型檢測及宮頸液基細胞學檢查，根據組織病理學結果將150例患者分別記為慢性宮頸炎組47例，低級別上皮內病變組43例，高級別上皮內病變組31例，宮頸癌組29例。

納入標準：（1）受檢者有性生活史；（2）無免疫疾病者；（3）配合檢查；（4）受檢前3 d無陰道沖洗及放藥，24 h內無性生活。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）妊娠期貨月經期；（3）子宮切除史；（4）近期內有服用抗生素及免疫抑制劑。

1.2 檢測方法 陰道分泌液中PD-1、PD-L1、MIF檢測方法及陽性標準：將門診完成取材的陰道分泌物送至門診實驗室進行陰道分泌物檢測，采用免疫組織化學SP法檢測標本中的PD-1、PD-L1、MIF水平，將檢測樣本進行石蠟包埋樣本切片處理，將切片放置在30%的乙醇中進行處理，放置在45～50℃水槽中進行展片，放入45℃的溫箱中進行干燥，之后在蒸餾水中浸泡1 min進行水化，在蘇木素水溶性溶液中進行染色，待HE染色玻片制備完成后，在顯微鏡下觀察宮頸癌癌細胞和浸潤淋巴細胞染色情況。檢測過程中使用的MIF鼠抗人單克隆抗體、小鼠單克隆抗體to PD1、小鼠單克隆抗體IgG1抗體均購自美國abcam公司。

1.3 判定標準 PD-1、PD-L1、MIF以包膜和細胞質呈棕黃色著色為陽性[7]。每個切片選取5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計數陽性細胞百分數，同時觀察陽性細胞染色強度。以陽性細胞百分數計數：≤5%為0分，6%～35%為1分，36%～65%為2分，≥65%為3分；以染色強度計分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分，將兩種計分的相加的總分進行判斷，評分＞2分為陽性，≤2分為陰性。

1.4 HR-HPV檢測 將取材好的標本封裝固定，送至病理科實驗室，宮頸HPV采用Cobas 4800 HPV DNA檢測方法進行檢測，根據宮頸脫落細胞DNA及β-globin的Ct值判讀確定HR-HPV陽性結果。

1.5 觀察指標 （1）收集不同宮頸病變組患者的臨床資料，包括年齡、初次性生活年齡、分娩次數，比較資料的均衡性。（2）比較不同宮頸病變患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平。（3）比較不同宮頸病變患者HR-HPV感染情況。（4）比較HR-HPV感染與HR-HPV未感染患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平。（5）采用Spearman相關性分析PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的關系。

1.6 統計學分析 采用SPSS 18.0統計分析數據，計量資料用（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用百分數表示，比較用χ2檢驗，采用Spearman相關性分析PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的關系，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者的臨床資料比較 四組患者的年齡、初次性生活年齡、分娩次數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組患者的臨床資料比較[（n）%]

2.2 各組患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平比較隨著宮頸組織病變的進展PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈增高趨勢，組間比較有差異(P＜0.05)，且PD-1、PD-L1、MIF在SCC組表達水平顯著高于其他三組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平比較[(n)%]

2.3 不同級別的宮頸病變中HR-HPV感染情況比較 四組不同程度的宮頸病變HR-HPV陽性率分別為31.91%、65.12%、83.87%、100.00%，HR-HPV陽性率隨著宮頸病變嚴重程度的加重而升高，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同級別的宮頸病變中HR-HPV感染情況比較[(n)%]

2.4 HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達比較HR-HPV(+)組的PD-1、PD-L1、MIF表達水平高于HR-HPV(-)組，兩組比較差異具有統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達比較[(n)%]

2.5 相關性分析Spearman相關性分析，HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關（P＜0.05），宮頸病變程度與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關（P<0.05）。見表5。

表5 PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的相關性分析

2.6 PD-1、PD-L1、MIF在宮頸組織中陽性表達顯微鏡染色圖片。見圖1。

圖1 a、b、c分別為PD-1、PD-L1、MIF在宮頸組織中陽性表達的顯微鏡染色圖片

3 討論

HPV是球形DNA病毒感染引起的一種性傳播疾病，可能導致腫瘤或尖銳濕疣或皮膚的黏膜的贅生物[8]。HPV病毒有兩百種左右的亞型，人的皮膚和黏膜最常見的感染大概有幾十種，根據它引起癌變的風險可分為高危型和低危型[9]。持續性的、高危型的HPV感染是宮頸癌和宮頸癌前病變發生的重要原因[10]。臨床治療宮頸癌是以化療、放療、手術治療等綜合治療為主，近年來細胞免疫治療引起了越來越多醫學工作者的關注。

本研究發現隨著宮頸組織病變的進展PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈增高趨勢，組間比較有差異，且PD-1、PD-L1、MIF在SCC組表達水平顯著高于其他三組。分析可能的原因是一種重要的免疫抑制分子，為免疫球蛋白超家族。PD-L1是一種跨膜蛋白，免疫系統的抑制有關[11]。PD-1與PD-L1結合，可以傳導抑制性的信號，減低淋巴結CD8+T細胞的增生，而且PD-1還可以借由調節Bcl-2基因，控制淋巴結中抗原特異性T細胞的聚積，促進腫瘤的免疫逃逸[12]。MIF是一種內分泌免疫物質，能夠限制體內巨噬細胞的活動，有助于腫瘤細胞的增殖[13]。這點與PD-1、PD-L1、MIF的陽性表達在宮頸炎、低級別上皮內病變、高級別上皮內病變、宮頸癌患者依次增高可以得到印證。研究發現四組不同程度的宮頸病變HR-HPV陽性率分別為31.91%、65.12%、83.87%、100.00%，HR-HPV陽性率隨著宮頸病變嚴重程度的加重而升高，組間比較差異顯著。HPV/hr是指高危型HPV，檢查有高危型HPV陽性，需要進一步做HPV分型檢查，明確是否有HPV16、18這兩個亞型感染。如果HPV16/18陽性，需要進一步做陰道鏡檢查+宮頸活檢，明確是否有宮頸病變。在有性生活的女性中，HPV感染很普遍，最初可以誘導女性發生低級別的鱗狀上皮內病變，其中大部分在機體免疫應答中清除，少部分會進展為宮頸癌。如果檢查結果是其他高危型HPV陽性，但是TCT檢查結果是正常的，可以定期復查，每年做一次宮頸TCT和HPV檢查。提示HR-HPV是宮頸病變發生的重要原因，與當前國內外研究基本一致[14]。研究發現HR-HPV(+)組的PD-1、PD-L1、MIF表達水平高于HR-HPV(-)組，兩組比較差異具有統計學意義。HPV感染后，大多數患者可以通過自身的免疫調節進行清除，少數患者會持續感染，發展為宮頸上皮內瘤，甚至癌變。近來不少研究顯示機體免疫調節對HPV引發的致癌過程至關重要，HPV能夠逃避免疫監視，與PD-1、PD-L1、MIF細胞免疫因子在免疫調節過程中發揮作用有很大關系。有研究認為HPV可能與細胞免疫因子共同促進癌癥的演變[15]。PD-1與PD-L1結合可以抑制T細胞增殖，并促進T細胞凋亡，提高CD8細胞毒性T細胞功能，促進抗腫瘤免疫應答。Spearman相關性分析，HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關，宮頸病變程度與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關。提示PD-1、PD-L1、MIF與HPV感染和宮頸病變進程密切相關，對宮頸癌的診斷與預防具有主要的參考價值。

綜 上 所 述，PD-1、PD-L1、MIF表 達 水 平 與HR-HPV感染及宮頸病變程度呈正相關，表明PD-1、PD-L1、MIF表達可能與腫瘤的發生、發展過程密切相關，定期檢測對患者的病情發展具有一定的指導作用。