高血壓腦出血患者術(shù)后外周血SIRT1、PINK1、Parkin表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

栗向軍，張鵬遠(yuǎn)

（1.鄭州頤和醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450000）

高血壓腦出血（Hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH）是由于長(zhǎng)期高血壓所致的腦部自發(fā)性出血[1]。多數(shù)患者發(fā)病前無明顯前驅(qū)癥狀，起病急驟，表現(xiàn)為突然出現(xiàn)的劇烈頭痛、惡心、嘔吐，多伴有肢體功能障礙、感覺障礙、失語等癥狀，若未及時(shí)治療，可出現(xiàn)顱內(nèi)壓增高，引起血腫側(cè)瞳孔散大等危機(jī)患者生命的體征[2]。中國(guó)腦出血診治指南（2019版）數(shù)據(jù)顯示[3]，我國(guó)每年HICH新發(fā)人數(shù)越為17～21萬人，發(fā)病30 d的病死率高達(dá)35%～52%，僅有約20%的患者治療后6個(gè)月內(nèi)能夠恢復(fù)基本生活功能。因此，其治療及預(yù)后難度是目前臨床亟待解決的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。已有研究報(bào)道[4]，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）是一種編碼廣泛表達(dá)的NAD依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰基酶，可通過使組蛋白去乙酰化作用調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，起到血管內(nèi)皮保護(hù)作用。PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以反映線粒體的損傷[5]。Parkin蛋白廣泛分布于腦內(nèi)，參與細(xì)胞周期、生長(zhǎng)代謝、免疫應(yīng)答和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)[6]。本研究旨在探討外周血中SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平對(duì)HICH患者術(shù)后不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，以期為臨床診斷和預(yù)后評(píng)估預(yù)后提供更多循證數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年6月至2021年6月在本院診治的102例HICH患者，根據(jù)術(shù)后格拉斯哥昏迷評(píng)分（GCS）情況分為預(yù)后良好（GOS≥7分）組（n=73）和不良（GOS＜7）組（n=29）。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《高血壓性腦出血中國(guó)多學(xué)科診治指南》[7]中相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；經(jīng)影像學(xué)診斷為腦出血；存在高血壓史；臨床資料完整；通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：非高血壓引起的腦出血者；存在嚴(yán)重心、肝、腎疾病者；合并自身免疫性疾病者。預(yù)后良好組與不良組在性別、年齡、出血部位等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者的一般資料比較[n，±s]

組別n 年齡（歲）性別（n）男女皮質(zhì)出血部位（n）內(nèi)囊基底節(jié) 丘腦 小腦良好組不良組t/χ2 P 73 29 60.83±7.42 61.71±6.18 0.565 0.659 51 16 1.987 0.159 22 13 13 8 39 12 1.602 0.659 14 6 7 3

1.2 方法

1.2.1 外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)檢測(cè)主要儀器與試劑：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)thermo公司），Hanks液（Solar bio公司），淋巴細(xì)胞分層液（Solar bio公司），BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物），5X蛋白上樣緩沖液（上海生工），PVDF膜（深圳市凱宏膜），SIRT1、PINK1、Parkin單克隆抗體（武漢ABclonal公司）。

方法：取靜脈血2 mL解凍，加入同體積Hanks液混勻，緩慢加入裝有同體積淋巴細(xì)胞分層液的試管中，離心沉淀（1 500 r/min，20 min），保留中間云霧層細(xì)胞液，繼續(xù)加入5倍體積的Hanks液，同樣轉(zhuǎn)速離心5 min，保留分離后的PBMC；取40μL的PBMC稀釋液，加入350μL細(xì)胞裂解液，嚴(yán)格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，BCA蛋白定量，Western blot蛋白印跡法檢測(cè)PBMC中SIRT1、PINK1、Parkin蛋白的表達(dá)水平，依次SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜、室溫密封2 h，洗膜并加一抗4℃孵育過夜，洗膜加二抗室溫孵育2 h。再用ECL化學(xué)發(fā)光顯示，收集影像，通過Image J凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)比條帶強(qiáng)弱，選用β-actin作為內(nèi)參，分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 觀察指標(biāo) 根據(jù)本研究目的，自行設(shè)計(jì)調(diào)查表，通過電子病例系統(tǒng)收集所有納入對(duì)象的性別、年齡、出血部位、出血量、主演時(shí)間、術(shù)后2 h格拉斯哥昏迷評(píng)分（Glasgow coma scale，GCS）等一般資料，資料收集工作由醫(yī)院專職人員完成。

GCS的總分為15分，一般來說，12～15分為輕型昏迷；7～12分為中度昏迷；而7分以下為重度昏迷（預(yù)后不良）[8]。分析外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)與GCS評(píng)分的相關(guān)性及對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料（±s）兩組間差異采用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析；計(jì)數(shù)資料（n，%）組間差異采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)與GCS評(píng)分的相關(guān)性，采用受試者 工 作 特 征 （Receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)對(duì)HICH患者術(shù)后預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，P＜0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者手術(shù)相關(guān)指標(biāo)比較 兩組患者的住院時(shí)間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不良組出血量高于良好組、術(shù)后GCS評(píng)分低于良好組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者手術(shù)相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組患者手術(shù)相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

組別 n良好組不良組73 29 t P出血量（mL）術(shù)后G C S評(píng)（分）46.94±4.56 58.22±3.29 12.112＜0.001 10.16±2.47 5.28±1.35 10.041＜0.001住院時(shí)間（d）7.21±1.22 7.65±2.34 1.242 0.217

2.2 兩組患者的外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平 不良組患者外周血PINK1水平明顯高于良好組，SIRT1、Parkin水平明顯低于良好組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 兩組患者的外周血SIRT1、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)條帶圖

表3 兩組患者的外周血SIRT1、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平（±s）

表3 兩組患者的外周血SIRT1、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平（±s）

組別 n良好組不良組73 29 t P SI R T1 P I N K1 0.48±0.07 0.27±0.08 13.117＜0.001 0.52±0.01 0.74±0.02 20.303＜0.001 P a r k in 0.89±0.02 0.51±0.03 14.498＜0.001

2.3 外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)與GCS評(píng)分的相關(guān)性 以術(shù)后GCS評(píng)分作為自變量，外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)作為因變量，術(shù)后GCS評(píng)分與外周血PINK1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.683，P＜0.001），與SIRT1、Parkin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.753、0.819，P＜0.001）。

2.4 外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平對(duì)不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 以外周血SIRT1、PINK1、Parkin單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)作為檢驗(yàn)變量，是否發(fā)生不良預(yù)后作為狀態(tài)變量進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積AUC分別為0.757、0.769、0.767、0.856(P＜0.05)。見圖2、表4。

圖2 外 周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平對(duì)不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

表4 外 周 血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平對(duì)不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

HICH是由于長(zhǎng)期高血壓導(dǎo)致腦內(nèi)小動(dòng)脈管壁發(fā)生變性、缺血、壞死、微小動(dòng)脈瘤形成等病理改變，當(dāng)血壓驟然升高時(shí)，導(dǎo)致小動(dòng)脈血管發(fā)生破裂出血；該病按出血部位分為基底節(jié)區(qū)出血、丘腦出血、腦葉出血、小腦出血和腦室出血[9]。HICH的治療包括內(nèi)科治療和外科治療，治療原則以控制出血、降低顱內(nèi)壓和防治并發(fā)癥的發(fā)生為主[10]。手術(shù)治療可有效清除血塊、降低顱內(nèi)壓和減少血腫對(duì)周圍腦組織的損傷，最大程度降低致殘率[11]。既往研究報(bào)道，HICH手術(shù)的預(yù)后與出血部位、出血量的情況密切相關(guān)[12]，本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良組與良好組的出血量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，出血部位無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與上述結(jié)論存在部分差異，分析原因可能是本次研究樣本數(shù)量較少，且為回顧性研究，可能存在部分個(gè)體差異。但同樣可提示對(duì)于出血量較高的患者，臨床需重點(diǎn)關(guān)注，實(shí)時(shí)檢測(cè)其生命體征，預(yù)防不良預(yù)后發(fā)生。

目前HICH術(shù)后發(fā)生不良預(yù)后的發(fā)病原因尚無統(tǒng)一的明確標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)研究報(bào)道[13]，繼發(fā)性腦損傷是影響HICH預(yù)后的關(guān)鍵，而神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等是繼發(fā)腦損傷的重要因素。中國(guó)腦出血診治指南報(bào)道[3]，GCS評(píng)分能夠作為評(píng)估腦出血患者的預(yù)后指標(biāo)，本此研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組的GCS評(píng)分明顯低于良好組，且低于預(yù)后不良的臨界值，進(jìn)一步證實(shí)了GCS評(píng)分可作為預(yù)后不良的判定指標(biāo)。已有研究報(bào)道[14]，SIRT1是存在于多種生物中的高度保守基因，在多種疾病中參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶的活性，改善內(nèi)皮功能。PINK1、Parkin位于同一條信號(hào)通路上，共同發(fā)揮線粒體自噬作用。相關(guān)研究報(bào)道[15-16]，健康狀態(tài)下，細(xì)胞PINK1表達(dá)較低，因?yàn)榫€粒體內(nèi)膜上的蛋白酶對(duì)其有降解作用；Parkin蛋白具有良好的調(diào)節(jié)和控制作用，可維持多巴胺能神經(jīng)元的正常功能，防止腦組織進(jìn)一步損傷。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不良組患者外周血PINK1水平明顯高于良好組，SIRT1、Parkin水平明顯低于良好組，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，分析其原因可能是，SIRT1能夠使p53去乙酰化，阻斷其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用[17]；而PINK1異常增加導(dǎo)致線粒體自噬障礙，進(jìn)而導(dǎo)致Parkin缺陷，因此預(yù)后不良患者外周血PINK1水平較高、，SIRT1、Parkin水 平 較 低。 提 示SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)可作為預(yù)測(cè)HICH術(shù)后不良預(yù)后的指標(biāo)。

國(guó)外研究報(bào)道[18-19]，SIRT1、PINK1、Parkin作為氧化應(yīng)激的重要調(diào)控因子，與多種疾病的嚴(yán)重程度、病情發(fā)展以及預(yù)后恢復(fù)效果密切相關(guān)。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后GCS評(píng)分與外周血PINK1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān) （r=-0.683，P＜0.001），與SIRT1、Parkin蛋 白 表 達(dá) 呈 正 相 關(guān) （r=0.753、0.819，P＜0.001），進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，說明隨著腦血管損傷病情加重，外周血PINK1表達(dá)異常減少、SIRT1、Parkin表達(dá)異常增多，分析其原因可能是，GCS評(píng)分與患者的意識(shí)狀態(tài)、語言反應(yīng)和肢體運(yùn)動(dòng)三個(gè)方面有關(guān)，若分?jǐn)?shù)越低，意識(shí)障礙越嚴(yán)重，表明腦損傷程度越嚴(yán)重，則外周血PINK1表達(dá)減少、SIRT1、Parkin表達(dá)增多。提示SIRT1、PINK1、Parkin可作為預(yù)測(cè)預(yù)后不良的指標(biāo)。本次研究中，進(jìn)一步以外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)作為檢驗(yàn)變量，是否發(fā)生不良預(yù)后作為狀態(tài)變量進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積AUC分別為0.757、0.769、0.767、0.856，進(jìn)一步證實(shí)外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)可作為高血壓出血患者術(shù)后不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其中聯(lián)合檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值高于單獨(dú)檢測(cè)，提示臨床可根據(jù)患者實(shí)際病情結(jié)合三項(xiàng)蛋白表達(dá)情況預(yù)防不良預(yù)后，防止病情復(fù)發(fā)或進(jìn)一步惡化。

綜上所述，HICH患者術(shù)后外周血SIRT1、PINK1、Parkin表達(dá)對(duì)不良預(yù)后有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，SIRT1和Parkin蛋白表達(dá)越低、PINK1表達(dá)越高，GCS評(píng)分越低，預(yù)后不良發(fā)生率越高。但本研究仍有一定的局限性，一是樣本量相對(duì)較小，二是檢測(cè)指標(biāo)均為血清樣本指標(biāo)，因此在統(tǒng)計(jì)分析上可能會(huì)有偏差。需要進(jìn)一步采用對(duì)應(yīng)的基因治療前瞻性研究進(jìn)行深入探索，以期為防治HICH的術(shù)后不良預(yù)后提供更加全面的循證支持。