急性淋巴細胞白血病患者外周血A KT信號通路關鍵蛋白的磷酸化和Netrin-1蛋白表達水平及意義

魯瀟，史芳瑜，李雅欽

（1.南陽市中心醫院急診內科；2.南陽市第一人民醫院腫瘤實驗室；3.南陽市中心醫院綜合治療室，河南 南陽 473000）

急性淋巴細胞白血病 （Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是由于原始淋巴細胞在造血組織中異常增殖并浸潤各組織器官的惡性克隆性疾病，本病常見于兒童，臨床主要表現為面色蒼白、疲勞無力、皮膚瘀點及鼻出血等[1-3]。目前，ALL發病機制尚未完全明確，可能與病毒感染、免疫功能異常、物理及化學等因素有關。近年來，隨著醫學技術不斷發展，ALL的治愈率得到提高，但部分亞型患者仍缺少相關治療手段，既往研究顯示[4]，ALL中相關細胞的生長、轉錄存在多種信號通路的異常，故對相關信號通路進行分析研究對臨床選擇合適治療手段意義重大，可提高患者治愈率。外周血絲/蘇氨酸激酶（Serine/Threonine kinase，AKT）信號通路在多種惡性腫瘤的發生發展中被異常激活后，導致患者預后較差[5]。神經導向因子1(Neurodirecting factor 1，Netrin-1)不僅在神經細胞的遷移、凋亡中發揮重要作用，在非神經組織的分化中也有參與，與ALL的發生發展密切相關[6-7]。因此，本文旨在探討ALL患者外周血AKT信號通路關鍵蛋白的磷酸化及Netrin-1蛋白的表達意義，以期為臨床治療提供新的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2020年6月于本院確診的92例ALL患者作為觀察組，另選取同期在本院進行體檢的健康者92例作為對照組。納入標準：（1）符合ALL診斷標準[8]；（2）本研究經醫院倫理委員審核批準通過，患兒監護人了解且知情同意。排除標準：（1）存在重要臟器病變者；（2）存在精神障礙者；（3）存在其他感染疾病患者；（4）存在免疫系統疾病患者。觀察組男52例，女40例，年齡2～9歲，平均（5.54±1.67）歲，身體質量指數（Body Mass Index，BMI）10.25～15.70 kg/m2，平均（12.48±0.59）kg/m2；對照組男47例，女45例，年齡2～9歲，平均（5.31±1.42）歲，BMI 10.25～15.70 kg/m2，平均（12.72±0.59）kg/m2。兩組患者年齡、性別及BMI等一般資料無顯著差異（P＞0.05）。

1.2 檢測方法

1.2.1 治療方案 所有ALL患者均采用常規輸血、抗感染及水化等基礎治療，并使用CCLG-ALL-2008化療方案，28 d為一個療程。

1.2.2 血常規檢測 在患者入院時，采用SYSMEXXE-2100D全自動血細胞分析儀檢測患者外周血血常規，包括白細胞計數（White blood cell count，WBC）、血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）、血小板（Blood platelet，PLT）等。

1.2.3 炎癥因子 在患者入院時，于清晨采集所有患者空腹靜脈血2 mL，靜置30 min待血液分離出血清后，經離心（10 min，3 000 r/min）后取上層清液，放置于-20℃條件下保存。使用免疫比濁法檢測血清C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（Procalcitonin，PCT）水平，試劑及試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。使用酶聯免疫吸附 試 驗 法 （Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測白細胞介素-6（Intedeukin，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），儀器選擇美國Bio-Rad i Mark680多功能酶標檢測儀，試劑及試劑盒為儀器配套的，檢測步驟按照說明書執行。

1.2.4 Netrin-1水平的檢測及Western blot檢測AKT、P-AKT信號通路表達 于治療結束時采集所有患者空腹靜脈血2 mL，靜置30 min待血液分離出血清后，進行離心（10 min，3 000 r/min）處理，取上層清液放置于-20℃條件下保存。采用ELISA檢測Netrin-1水平。試劑及試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司，操作步驟嚴格按照操作說明書進行。先通過密度梯度離心法分離單個核細胞，再采用RIPA細胞裂解液提取單個核細胞總蛋白，經BCA蛋白測定試劑盒（艾美捷科技有限公司）檢測蛋白質濃度。將蛋白質利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后電子轉移到聚偏二氟乙烯膜，加入質量分數5%的脫脂奶粉并密封2 h。依次加入一抗（1×TBST稀釋至1∶1 000），在4℃環境中孵育過夜，使用TBST緩沖液洗膜3次，8min/次，使用辣根過氧化物酶偶聯的二抗（1×TBST稀 釋 至1∶20 000，Abcam；1×TBST稀 釋 至1∶20 000，Sigma-Aldrich）孵育膜，室溫孵育1 h，使用TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，電化學發光顯影，選用β-actin作為內參，利用凝膠成像系統分析對比條帶強弱。

1.3 隨訪 患者于治療后的1年內每3個月進行門診復查，隨訪截止時間為2021年6月，期間記錄患者復發情況、生存時間及隨訪時狀態（存活、死亡或其他）等。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件對本研究內容數據進行處理，滿足正態分布的計量資料均以均數±方差（±s）表示，組間差異比較使用兩樣本獨立t檢驗；計數資料均以n或%表示，組間差異比較采用χ2檢驗；采用Graphpad prism 5.0分析生存資料，采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，比較采用Log-rankχ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者血常規比較 觀察組WBC水平顯著高于對照組，PLT、Hb水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者血常規比較（±s）

表1 兩組患者血常規比較（±s）

組別 n觀察組對照組92 92 t P W BC（×109/L）P L T（×109/L）10.89±0.82 8.62±0.75 19.593＜0.001 187.47±8.25 252.43±20.37 28.351＜0.001 Hb（g/L）134.35±14.82 147.67±15.32 5.994＜0.001

2.2 兩組患者炎癥因子比較 觀察組CRP、PCT、IL-6、TNF-α水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者炎癥因子比較（±s）

表2 兩組患者炎癥因子比較（±s）

組別觀察組對照組n 92 92 t P CRP（mg/L）12.89±0.82 8.62±0.75 36.855＜0.001 PC T（μg/L）I L-6（ng/L）7.47±1.25 0.43±0.09 53.881＜0.001 32.68±8.65 5.47±1.21 29.881＜0.001 T N F-α（ng/L）13.53±2.58 7.25±1.21 21.138＜0.001

2.3 兩組患者Netrin-1水平、AKT、p-AKT信號通路表達水平 觀察組患者Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。見表3、圖1（Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白結果來自所有患者，圖片來源于其中一個患者）。

圖1 兩組患者的Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白表達水平

表3 兩組患者Netrin-1水平、A KT、p-A KT信號通路表達水平

2.4 Netrin-1水平的表達與ALL患者預后分析ALL患者中Netrin-1高表達水平生存率為76.09%，顯著低于低表達水平的84.78%，差異有統計學意義（Log-rankχ2=3.240，P=0.037）；ALL患者中Netrin-1高表達水平無病生存率為45.65%，中位生存期為7.52個月，顯著低于低水平表達患者（50.00%，10.02個月），差異具有統計學意義（Logrankχ2=7.792，P=0.005），見圖2。

圖2 Netrin-1水平的表達與ALL患者預后分析

3 討論

ALL屬于一種造血系統的惡性疾病，多發于小兒。近年來，隨著醫學技術的不斷發展，ALL5年生存率可達80%[9]，但部分患者預后仍較差，故尋找新的相關因素和靶點對ALL的治療十分重要。AKT在人體中的作用較為廣泛，在多個信號通路中起重要作用，有利于維持細胞正常功能，可利用磷酸化作用產生相應的變化來應對環境改變[10]。Netrin-1作為Netrin家族的一員，在多種腫瘤細胞中均存在缺失或高表達現象，可促進癌細胞的發生發展[11]。且既往研究顯示[12]，Netrin-1可通過激活整合蛋白（Integrin）受體，調控AKT信號通路，從而影響細胞的增殖、分化過程。因此，本文研究了ALL患者外周血AKT信號通路關鍵蛋白的磷酸化和Netrin-1蛋白表達水平及意義。

WBC是機體防御組織重要的組成部分，可吞噬異物并產生抗體，抵抗病原體入侵及具有相應的自愈能力[13]。PLT可保護毛細血管的完整性，有助于臨床上幫助判斷止血和血栓性疾病。Hb是一種胞漿內的蛋白質，負責將氧氣從肺運輸到身體其他組織。TNF-α主要由巨噬細胞分泌，具有防御病原體、抑制腫瘤的發生、免疫調節和誘導炎癥介質等作用。IL-6是一種功能廣泛的多效性細胞因子，可調控多種細胞的生長與分化，具有急性期反應和造血功能等作用，在機體的抗感染免疫反應中起重要作用；PCT是一種蛋白質，其在機體中的含量與嚴重感染及多臟器功能衰竭嚴重程度密切相關，CRP是一種急性蛋白，可激活補體、加強吞噬細胞的吞噬的調理作用，且能夠對細菌和病毒感染的進行鑒別。本研究結果顯示，觀察組WBC、CRP、PCT、IL-6、TNF-α水平顯著高于對照組，PLT、Hb水平顯著低于對照組，這可能是由于ALL患者機體受到病毒或細菌感染后，促進免疫炎癥反應的發生及WBC水平的升高，可誘導多種炎癥因子表達量升高，從而使細胞受到損傷，加重ALL患者臨床癥狀。

本研究結果顯示，觀察組患者Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白表達水平均顯著高于對照組。AKT又稱之為蛋白激酶 B （Protein kinase B,PKB），AKT信號通路作為細胞內信號轉導的重要環節，參與細胞增殖、分化、凋亡和免疫調節等多種生理過程[14]。因AKT在N端調節區域含有普列克底物蛋白同源物（Pleckstrinhomology，PH）結構域，PH結構域是一種功能性區域，存在多種信號蛋白和細胞骨架相關蛋白，而血小板內主要的PKC的底物普列克底物蛋白（Pleckstrin）中的一段重復序列與AKT具有同源性，可導致蛋白質-蛋白質的相互作用[15-16]。近年來相關研究表明[17]，AKT的異常活化與ALL的發生、發展及轉移密切相關。觀察組AKT、p-AKT蛋白表達水平高于對照組，提示AKT信號通路關鍵蛋白的磷酸化參與ALL病理機制的發生，在激活炎癥反應中具有重要作用。AKT蛋白在磷脂酰肌醇-3-羥基激酶（Phophatidylinsotitol-3-kinase，PI3K）作用下被充分激活，使AKT發生磷酸化，調控炎癥介質基因轉錄過程，從而使患者病情加重。既往研究顯示[18]，Netrin-1可增強白血病細胞的增殖能力，在多種癌細胞中存在高表達，且轉移性強，觀察組Netrin-1水平高于對照組，說明Netrin-1可能參與ALL發生過程。此外，有學者認為[19]，Netrin-1可能通過激活AKT信號通路來促進白血病細胞的增殖與分化，進而使免疫炎癥反應紊亂，導致機體出現異常。本研究分析了Netrin-1的表達與ALL患者生存率之間的關系，發現Netrin-1高表達患者的總生存率和無病生存率均顯著低于Netrin-1低表達，表明Netrin-1與ALL疾病的發展密切相關，可作為預后相關分子標識物。

綜上所述，ALL患者外周血中的Netrin-1蛋白表達水平存在異常，可能通過調控AKT信號通路，使炎癥反應加重，從而促進ALL患者病情加重，且Netrin-1高表達患者的總生存率及無病生村率均顯著低于Netrin-1低表達患者。