首次于青海省發現Pectobacterium polaris引起馬鈴薯黑脛病

劉思邈，孫清華，張鳳軍，馬永強，馮志文，張若芳*

（1.內蒙古大學馬鈴薯工程技術研究中心，內蒙古 呼和浩特 010021；2.青海大學農林科學院，青海 西寧 810016）

馬鈴薯原產于南美洲安第斯山高山區，由于其塊莖具有較高的營養價值，是僅次于水稻和小麥的全球第三大糧食作物[1]。在中國馬鈴薯種植范圍較為廣泛，覆蓋了東北、華北、西北、西南和華南各地區，種植面積達4.67×106hm2左右。但隨之而來的是馬鈴薯病蟲害對其產量的影響日益突出，其中黑脛病為生產上廣泛發生的病害之一，發病嚴重時田間發病率可達50%以上，嚴重降低了馬鈴薯的產量和品質，使種植戶遭受巨大經濟損失。

馬鈴薯黑脛病是一種細菌性病害，一般是種薯帶菌開始腐爛，傳至地下莖，地下莖腐爛后傳至地上莖基部，維管束病變部位呈現黑褐色，植物葉片開始萎蔫，莖基部撕裂折斷；后期病菌通過匍匐莖傳入到新的塊莖中，導致新生塊莖腐爛。馬鈴薯黑脛病病原菌屬于果膠桿菌屬（Pectobacteriumspp.）和狄克氏菌屬（Dickeyaspp.），果膠桿菌科（Pectobacteriaceae），變形菌門（Proteobacteria）[2]，其宿主范圍廣泛，包括馬鈴薯在內的其他蔬菜作物以及觀賞植物[3]。其中果膠桿菌屬和狄克氏菌屬分布尤為廣泛，已報道可以侵染39 個科的86 種不同植物[4]。在中國，馬鈴薯黑脛病主要致病菌為果膠桿菌屬病原菌。該病原菌分布廣泛，在不同區域病原群體結構特征可能存在差異。本研究從青海省馬鈴薯產區病樣組織中分離致病菌，通過16S rRNA序列、多位點序列分析以及致病性進行病原菌的鑒定，比較分析不同菌株的致病力，期望了解不同區域的主要病原菌種類，為制定有針對性的黑脛病有效防控措施提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 分離和純化

2021年9月，在青海省西寧市（E101.74°，N36.56°）馬鈴薯產區（調查面積為30 hm2）發現疑似黑脛病感染植株（圖1），發病率為20%左右。從該產區采集到‘Favorita’疑似病株5 株，分離得到Pectobacteriumspp. 3 株 ， 命 名 為 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224。將樣品進行分離病原菌，首先將受黑脛病感染的植物莖部切下，在75%乙醇中浸泡2 min，用蒸餾水沖洗干凈，移至磨樣袋中，并加入無菌蒸餾水，充分研磨，保留上清液，將上述溶液梯度稀釋，接種到結晶紫果膠酸瓊脂（Crystal violet pectate，CVP）平板上，28℃孵育2～3 d[5]，用牙簽挑取在CVP 平板上出現的單個細菌菌落，并在營養瓊脂上劃線，以獲得純菌落。

圖1 田間馬鈴薯植株黑脛病癥狀Figure 1 Symptoms of blackleg on potato plant from the field

1.2 供試菌株DNA提取

將所分離到的細菌置于營養肉湯（Nutrient broth，NB）培養基中，28℃，200 r/min 振蕩培養16 h，將細菌懸浮液在12 000 r/min 下離心2 min，使用TaKaRa Mini BEST 細菌基因組DNA 提取試劑盒進行細菌基因組DNA的提取。

1.3 16S rRNA基因序列分析

使用通用引物8F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGA CTT），對待測菌株進行16S rRNA 基因擴增，反應體系為：Green Mix，12.5 μL，引物各 0.6 μL，模板 1.0 μL，ddH2O 10.3 μL，反應程序為：98℃，5 min；98℃，10 s，退火溫度 55℃，5 s，72℃，100 s，29 個循環；72℃，5 min。PCR 反應使用T100 TM 熱循環儀（美國Bio-Rad）完成。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，質量良好的PCR 產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行Sanger 測序，將獲得序列與GenBank 數據庫中己知序列進行Blast 比對，并利用MEGAX[6]軟件，使用最大似然法和Tamura-Nei model進行16S系統發育樹的構建。

1.4 多位點序列分析

采用多位點序列分析，對病原菌proA（MT427753-MT427756）、icdA（MT427761-MT427764）、mdh（MT427765-MT427768）、gapA（MT427769-MT427772）[4]、gyrA（MT427757-MT427760）和rpoS（MT427773-MT427776）[7]6個管家基因進行PCR擴增，反應體系為：Prime STAR HS DNA Polymerase（2×），12.5 μL，引物各0.6 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.3 μL，反應程序為：98℃，5 min；98℃，10 s，退火溫度59℃，5 s，72℃，1 min，29 個循環；72℃，5 min。PCR反應使用T100 TM 熱循環儀（美國Bio-Rad）完成。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，質量良好的PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行Sanger測序，將獲得序列與GenBank數據庫中己知序列進行Blast 比對，并利用MEGAX[6]軟件，使用最大似然法和Tamura-Nei model 進行MLSA 系統發育樹的構建。

1.5 致病性檢測

1.5.1 植株檢測

3株分離株菌懸液（106cfu/mL）以莖基部注射方式侵染馬鈴薯品種‘費烏瑞它’的幼苗（每株菌侵染5 株植株），以無菌水或營養肉湯（NB）培養基作為對照，幼苗生長環境保持在相對濕度80%、溫度21℃，侵染7 d后拍照記錄[8]。

1.5.2 薯塊檢測

選用‘Favorita’種薯，切成兩半，3株P.polaris菌株菌懸液（106cfu/mL）離心，棄上清液，沉淀加入無菌蒸餾水中制成混懸液，于馬鈴薯切面的四角及中間部位穿刺并注入100 μL 混懸液，以無菌水為對照，3 次重復[9]。接種后處理與對照分別包裹封口膜，以保持薯塊濕度，于28℃培養2～3 d，觀察發病情況。

2 結果與分析

2.1 16S rRNA基因序列分析

基于16S rRNA基因完整序列，以Dickeyaspp.菌株，以及Erwiniaspp.菌株為外群，將ZRIMU1222、ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌株序列（登錄號分別為：OP389242、OP389243 和 OP389244）與已發表的18 株果膠桿菌菌株的序列構建系統發育樹。結果顯示，本研究分離得到的3個菌株與P.polaris菌株構成了明顯的分枝，已發表的P. atrosepticum、P. brasiliense、P. carotovorum與P. parmentieri株系形成的類群則分別構成了獨立的分枝（圖2）。

圖2 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株16S rRNA基因序列的系統進化樹Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of three strains and other Pectobacterium strains

2.2 多位點序列分析

基于菌株的多位點rpoS-proA-gapA-icdA-gyrA-mdh堿基串聯序列，用Pectobacteriumspp.及其密切相關的物種Dickeyaspp.的菌株構建系統發育樹（圖3）。結果顯示，分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224親緣關系較近，與Pectobacterium polaris其他菌株聚集到一起，同屬一個分枝；與其他Pectobacteriumspp.，Dickeyaspp.以及Erwiniaspp.親緣關系較遠。由此，可以推斷出分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224這3株菌株具有較高的相似性，且均來源于果膠桿菌屬，屬于Pectobacterium polaris。

圖3 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株rpoS、proA、gapA、icdA、gyrA和mdh多位點序列的系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree based on the multi-locus sequence of rpoS,proA,gapA,icdA,gyrA,and mdh of three strains and other Pectobacterium strains

2.3 致病性檢測

用 106cfu/mL 的 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌液和營養肉湯（NB）培養基（對照）注入馬鈴薯品種‘費烏瑞它’的幼苗，結果顯示注射ZRIMU1222、ZRIMU1223 和 ZRIMU1224 菌液的幼苗均出現癥狀（莖基部腐爛發黑），而對照植株無病癥，注射傷口呈愈合狀態（圖4）。薯塊侵染3 d后，感染Pectobacterium的薯塊均表現出潰爛發臭的癥狀（圖4），對照組無病癥，薯肉緊實無潰爛癥狀。

圖4 基于科赫法則將分離株分別感染‘費烏瑞它’幼苗和塊莖Figure 4 'Favorita'seedlings and tubers infected with candidate pathogenic isolates for Koch's postulate test

3 討 論

馬鈴薯黑脛病是一種細菌性病害，在中國馬鈴薯產區發生嚴重，可發生在馬鈴薯生長發育的各個階段，通過影響出苗率、幼苗存活率降低產量，造成經濟損失[10]。由于馬鈴薯新品種的更新、檢疫制度不健全及種薯跨區調運頻繁，使得馬鈴薯黑脛病發生呈逐年上升趨勢[11]，新的致病菌逐步走入大眾的視野，Pectobacteriumspp.屬的種和亞種數量逐漸增加。在癥狀上，幾種致病菌引起的黑脛和軟腐癥狀是類似的，所以單單依靠表型特征和生理生化測試進行相同種或亞種之間的準確鑒別變得比較困難。DNA標記、血清學[12]、16S rRNA序列[13]以及多位點序列分析[14]，在許多植物病原細菌致病亞種和致病型區分方面有較多報道，是目前較常用的細菌系統發育分類方法。本研究運用生物信息學，通過對同源序列進行篩選、序列比對、進化樹構建、評估進化樹4個步驟，對其基因組進行分析，所得實驗結果均表明，分離的3 個Pectobacterium polaris菌株與已發表的Pectobacterium polaris株系共同形成了明顯的Pectobacterium polaris分枝，且該分枝與其他種（或亞種）形成了不同類群，由此可以推斷這3 株分離物屬于Pectobacterium polaris菌株。后續致病性檢測表明，3株分離株均滿足科赫法則，且被侵染的植株維管束病變部位均呈現黑褐色，被侵染的薯塊潰爛發臭。

目前，青海地區已檢測并報道的病原菌為Pectobacterium atrosepticum[15]，而Pectobacterium polaris病原菌株尚未報道。近幾年，歐洲國家，如波蘭[16]、俄羅斯[17]、土耳其[18]等對于Pectobacterium polaris均有報道。在中國，Wang 等[19]在河北，首次發現并報道了Pectobacterium polaris菌株，Handique等[20]在內蒙古自治區及四川省相繼報道了該菌株。本研究發現的3株病原菌Pectobacterium polaris在青海省為首次報道，期望此研究為后續致病機理的研究以及生防菌的開發奠定基礎。