孕期重金屬元素和微量元素水平與子代先天性心臟病相關性的前瞻性隊列研究

劉婧婷 周亞威 王文第 毛寶宏 虎亞光

（甘肅省婦幼保健院 1.婦幼保健科研中心；2.臨床檢驗中心；3.藥學部 甘肅蘭州 730050）

先天性心臟病（congenital heart disease），簡稱先心病，是一種心血管系統的結構異常，其特征表現為心臟及大血管解剖異常，是新生兒最常見的出生缺陷。在每1 000個活產新生兒中，就有6～12人罹患先心病［1］。在嬰幼兒中，先心病占出生缺陷病死率的30%～50%［2］。作為造成兒童發病和死亡的主要原因，先心病越來越引起廣泛關注。流行病學文獻研究表明，許多非遺傳性風險因素，例如孕婦吸煙史［3］、肥胖［4］、妊娠前糖尿病、孕產婦藥物暴露及環境暴露史［2］等可能增加子代先心病的風險。

在中國，重金屬污染和微量元素缺乏是一個重要的公共衛生問題。隨著信息技術的發展和工業化進程的加快，人群中鉛（plumbum，Pb）的暴露也隨之增加。研究表明，孕期鉛暴露水平與子代發生先心病的風險相關［5-6］。鋅（zinc，Zn）對兒童成長發育有關鍵影響。Zhu等［7］的研究證實，在孤立性室間隔缺損（ventricular septum defects，VSD）患兒中存在鋅元素的缺乏，且患兒Zn水平與主動脈直徑之間存在顯著關聯。然而，關于孕期重金屬暴露及微量元素缺乏與子代先心病相關性的觀察性研究多為回顧性研究［5-7］，結果可能存在一定偏倚。本研究為前瞻性出生隊列研究，通過評估甘肅地區母親孕期重金屬元素暴露及微量元素水平與新生兒罹患先心病風險之間的關系，建立孕期重金屬元素暴露和微量元素缺乏與子代先心病發生概率的預測模型，進而為孕產婦妊娠期環境暴露、生活習慣等提供一些建議，以期提高出生人口質量。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2010～2012年我院聯合耶魯大學開展了一項出生隊列研究。對我院定期產檢直至分娩的孕婦進行隨訪，使用標準化和結構化的問卷收集孕婦一般人口統計學信息、既往病史、生育史及飲食習慣、孕早/中/晚期是否有主動或被動吸煙、孕早/中/晚期是否飲酒、孕早/中/晚期葉酸及維生素補充情況等。該項隊列研究共納入研究對象14 359名，共有10 542名孕婦（73.42%）完成了問卷調查。研究人群的相關詳細描述見Qiu等［8］的研究。本研究從其中10 087例單胎活產的孕產婦（已排除多胎、死胎或其他出生缺陷等）中收集到子代罹患先心病者97名作為先心病組，對照組按照1∶2的比例進行配比。為保證研究人群的環境暴露因素相似，盡可能選擇與先心病組同年齡組、同小區（如不符合同小區，則在研究對象家庭住址5 km內選擇）的194名孕婦作為對照組（子代未患先心病）。所有產前診斷為先心病的活產嬰兒在分娩后均接受超聲心動圖檢查以確定診斷，至少有2名資深兒科心臟病專家在分娩后通過相關臨床檢查確診為先心病。本研究已征得孕婦本人知情同意，并獲得我院醫學倫理委員會批準［（2021）GSFY倫審（09）號］。

1.2 血液樣本的采集、貯存與檢測

采集孕婦孕20～24周靜脈血，胎兒臍帶血在分娩后立即采集，均置于EDTA抗凝管中。所有樣本經程序性冷凍后置于-80°C下冷凍，并在我院中心實驗室保存，然后運送至中科院蘭州化學物理研究所進行化學元素分析。使用電感耦合等離子體質 譜 法 （inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）檢測孕婦血液樣本及胎兒臍血樣本中鈷（cobalt，Co）、鎳（nickel，Ni）、鋁（aluminium，Al）、Zn、錳（manganese，Mn）、鈉（natrium，Na）、鎂（magnesium，Mg）、鉀（kalium，K）、鈣（calcium，Ca）、鈦（titanium，Ti）、釩（vanadium，V）、鉻（chromium，Cr）、鐵（ferrum，Fe）、銅（copper，Cu）、鎵（gallium，Ga）、砷（arsenic，As）、硒（selenium，Se）、鍶（strontium，Sr）、鉬（molybdenum，Mo）、銀（argentum，Ag）、鎘（cadmium，Cd）、錫（stannum，Sn）、銻（stibium，Sb）、鋇（barium，Ba）、汞（mercury，Hg）、鉈（thallium，Tl）、Pb、釷（thorium，Th）28種化學元素的濃度。

1.3 統計學分析

對孕婦的年齡分布、受教育程度、家庭人均月收入情況、孕期是否有吸煙及飲酒史等分類變量，使用百分比（%）描述，組間比較使用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗。各樣本中化學元素的水平等連續變量，因不符合正態分布，故使用中位數和四分位數間距［P50（P25，P75）］表示，組間比較采用Wilcoxon-Mann-WhitneyU檢驗。為了探究重金屬元素和微量元素水平與子代先心病的相關性，采用多因素logistic回歸模型分析預測子代罹患先心病的相關因素并構建預測模型，繪制相應的列線圖。使用R軟件，先將所有數據按75%∶25%的比例劃分為測試集和訓練集，調用“glm（）”函數建模分析。為了檢驗模型的預測效果，使用R軟件“caret”包下的“confusionMatrix（）”函數輸出模型校正后的OR（aOR）值、95%CI及P值。對于所有納入分析的變量，使用“glm（）”函數建立分析模型，調用“rms”包中的“nomogram（）”函數繪制列線圖［9］。對于列線圖的內部驗證采用Bootstrap自抽樣法，迭代1 000次進行內部驗證［9］。使用IBM SPSSStatistics 22.0軟件（IBM公司，芝加哥，美國）和R 4.0.2軟件及其擴展包進行統計學分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的人口學資料

先心病組和對照組孕婦的年齡分布、受教育程度、孕產史、家庭人均月收入情況、孕前體重指數、孕期是否工作、孕期是否有吸煙史、孕期是否有飲酒史及胎兒性別等方面的比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；先心病組妊娠高血壓比例及妊娠糖尿病比例均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組孕婦一般資料的比較 ［例（%）］

表1（續）

2.2 孕婦血液樣本和胎兒臍血樣本中重金屬元素和微量元素水平

與對照組相比，先心病組孕婦血液樣本中Al、Na、Ca、Ti、Se、Sr、Sn、Sb、Ba、Th水平較高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。先心病組胎兒臍血樣本中Al、Zn、Mg、K、Ca、Ti、Cr、Cu、As、Se、Sr、Ag、Cd、Sn、Pb水平較對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表2 先心病組與對照組孕婦血液化學元素水平的比較 ［P50（P25，P75），μg/L］

表3 先心病組與對照組胎兒臍血化學元素水平的比較 ［P50（P25，P75），μg/L］

2.3 孕婦血液樣本和胎兒臍血樣本中重金屬元素和微量元素水平與子代先心病的相關性

首先，對上述經秩和檢驗分析差異有統計學的化學元素，取對數后使用R軟件中的“glm（）”函數進行logistic分析，結果顯示孕婦全血中的Al和Th的水平可能與子代先心病的發病相關（P＜0.05）；胎兒臍血中的Al與Cd水平可能與先心病的發病相關（P＜0.05）。見表4～5。

表4 孕婦全血中化學元素水平與先心病的相關性

表5 胎兒臍血中化學元素水平與先心病的相關性

由于體內微量元素和金屬元素的水平受性別、年齡、地區等多種因素的影響，且各元素間也存在相互影響［10-12］，國內沒有統一的針對母血和臍血化學元素的參考范圍，本研究使用本研究中對照組孕婦血液樣本及胎兒臍血樣本的化學元素濃度，按其濃度分布的四分位數進行劃分，以P25～P75間距為參考標準，低于P25為低濃度水平，高于P75為高濃度水平，進行下一步分析。

多因素logistic回歸分析顯示，在調整表1基線資料比較中差異有統計學意義的混雜因素后，針對孕婦血液樣本中化學元素的水平，與中等濃度Sb水平相比，高濃度Sb水平的孕婦其子代患先心病的風險顯著增加（aOR=4.81，95%CI：1.65～14.07，P=0.004），見表6。而在胎兒臍血樣本中，高濃度水平的Al（aOR=4.22，95%CI：1.35～13.16，P=0.013）、Mg（aOR=8.00，95%CI：1.52～42.08，P=0.014）、Pb（aOR=3.82，95%CI：0.96～15.23；P=0.049）與先心病的發生風險增加存在關聯，見表7。

表6 孕婦全血中化學元素水平與先心病之間關系的多因素logistic回歸分析

表7 胎兒臍血中化學元素水平與先心病之間關系的多因素logistic回歸分析

表7（續）

2.4 孕期重金屬元素暴露和微量元素水平與子代先心病的預測模型

根據以上分析，孕期重金屬元素和微量元素水平與子代先心病的預測模型中納入的變量有：孕婦血Al、Th、Sb水平和胎兒臍血Al、Mg、Pb水平，繪制的列線圖見圖1。列線圖模型中將各元素的濃度以對照組孕婦血液樣本及胎兒臍血樣本濃度P25～P75間距為參考標準，低于P25為低濃度水平，高于P75為高濃度水平。使用方法：每個預測指標的數值所在區間對應本指標線段的某個刻度，由該刻度向評分標準的線段作垂直線即可得到相應的分值，總分即所有指標分值相加。再以總分線段上的對應分值點向先心病發生概率線段作垂直線，即可得到孕期重金屬元素和微量元素不同濃度條件下子代先心病的發生概率。例如，孕婦其外周血Al濃度為1 700μg/L，對應Al（孕婦血）線段“1 564.84～2 891.03”的刻度，因此該指標得分約為10分；Th濃度0.6μg/L，對應Th（孕婦血）線段“0.5～0.87”的刻度，該指標得分約為30分；Sb濃度6μg/L，對應Sb（孕婦血）線段“＜8.8”的刻度，得分約為20分；胎兒臍血中Al濃度為1 500μg/L，對應Al（臍血）線段“1 282.37～2 418.72”的刻度，因此該指標得分約為10分；Mg濃度為3 600μg/L，對應Mg（臍血）線段“＞35 138.35”的刻度，該指標得分約為75分；Pb濃度為40μg/L，對應Pb（臍血）線段“25.45～65.06”的刻度，得分約為50分。依次累計各指標的得分為195分，故對應的發生概率為35%～40%。該列線圖預測子代先心病模型的校正曲線趨近于理想曲線，見圖2。

圖1 預測子代先心病列線圖模型 每個預測指標的數值所在區間對應某個刻度，該刻度向評分標準的線段作垂直線即可得到相應的分值，總分即所有指標分值相加。以總分線段上的對應分值點向先心病發生概率線段作垂直線，即可得到孕期重金屬元素和微量元素不同濃度條件下子代先心病的發生概率。［Al］鋁；［Th］釷；［Sb］銻；［Mg］鎂；［Pb］鉛。

圖2 列線圖預測子代先心病模型的校正曲線

3 討論

本研究顯示，先心病組孕婦血液中Al、Na、Ca、Ti、Se、Sr、Sn、Sb、Ba、Th的含量均高于對照組。多因素logistic回歸分析顯示，血液樣本中Sb處于高水平的孕婦，其子代患先心病的風險顯著增加（aOR=4.81，P=0.004）；而在胎兒臍血樣本中，高濃度水平的Al（aOR=4.22，P=0.013）、Mg（aOR=8.00，P=0.014）、Pb（aOR=3.82，P=0.049）與先心病的發生風險增加存在關聯。研究表明，先心病組的孕婦，其頭發Pb含量（中位數0.670μg/mg）明顯高于對照組（0.461μg/mg），logistic回歸分析顯示孕婦Pb暴露水平與子代發生先心病的風險相關（aOR=3.07）［6］，本研究結果與之類似。Jackson等［13］的研究表明，孕婦Pb暴露的水平與其子代發生完全肺靜脈異常回流的可能性有關。Liu等［14］的研究顯示，先心病組患兒臍血Al水平明顯高于對照組（P=0.004），尤其是圓錐動脈干畸形、左/右心室流出道畸形及其他心臟結構異常的先心病患兒臍血Al水平與對照組有顯著差異。并且，與Al低水平組相比，Al高水平組子代先心病患病風險較高（aOR=2.08，95%CI：1.11～3.88），本研究結果與之一致。此外，Liu等［14］還觀察到，隨著臍血Al濃度升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性顯著降低（R2=0.019，P=0.012），丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）水平顯著升高（R2=0.018，P=0.016），說明孕母Al暴露對子代先心病發生的風險可能與氧化應激失衡有關。林元等［15］的研究顯示，先心病組孕婦頭發中Sb的含量高于對照組（P＜0.0001），并且孕婦頭發Sb升高其子代發生先心病的風險增加（OR=33.833；95%CI：4.060～281.929）。陳小紅［16］的研究也得到類似的結果，先心病組孕婦頭發Sb元素含量較對照組顯著升高（P＜0.0001），Sb水平升高與子代罹患先心病風險較高相關（OR=3.000，95%CI：1.348～6.678，P=0.007）。楊文慶等［17］的研究顯示，早產兒動脈導管未閉組血清Mg水平顯著高于對照組，母親產前使用硫酸鎂可能增加早產兒發生動脈導管未閉的風險，且存在劑量效應關系。然而，Yal?in等［18］的研究結果顯示，先心病組患兒全血Mg水平比對照組低［（41.4±5.3）mg/L vs（37.8±3.2）mg/L，P=0.001］，在調整了兒童年齡、性別、身高/年齡比和體重指數/年齡比等混雜因素后，先心病組患兒全血Mg水平比對照組低［（41.3±0.7）mg/Lvs（39.5±2.1）mg/L，P=0.027］。因此，孕婦Mg水平與子代先心病的患病風險之間的相關關系有待進一步研究。此外，本研究還顯示，孕婦血液中Th的水平與其子代先心病患病風險存在一定相關性，然而，國內外鮮有文獻報道這二者之間的關系。關于孕婦Th水平與子代先心病的風險關聯有待流行病學或動物實驗進一步證實。

綜上所述，孕婦血液標本與胎兒臍血標本中化學元素水平可用于預測子代罹患先心病的風險。孕婦血液樣本中Sb水平升高，其子代患先心病的風險顯著增加。而在臍血樣本中，高濃度水平的Al、Mg、Pb與先心病的發生風險增加存在關聯。結合logistic回歸模型，納入孕婦血Al、Th、Sb水平和臍血Al、Mg、Pb水平等指標構建的列線圖模型對于預測子代先心病的發生概率有良好的準確性及一致性，有助于制定相應干預措施，提早對于高危因素暴露下的孕產婦加強產前監測，以期對子代先心病進行早期識別并給予干預治療。然而，本研究仍存在一些不足。首先，胚胎心臟的發育在孕3～8周就基本完成，本研究未能獲得孕早期生物樣本，因此很難反映孕早期的真實暴露水平。其次，本研究的生物樣本及臨床信息收集于10年前，代表當時的環境暴露水平，可能與當前的環境暴露情況存在一定偏差，且本研究為單中心研究，未能納入其他中心同標準人群進行模型的外部驗證，導致結論可能存在一定偏倚。因此，該列線圖模型的實用價值仍有待于前瞻性、大樣本量、多中心的研究進一步驗證。