基于UPLC技術解析金萱×紫娟F1分離群體代謝物的遺傳變異

劉慶帥，璩馥榕，魏夢園，鐘紅，王熠，陳亮，金基強*

基于UPLC技術解析金萱×紫娟F1分離群體代謝物的遺傳變異

劉慶帥1,2，璩馥榕1,2，魏夢園1，鐘紅1,2，王熠1,2，陳亮1，金基強1*

1. 中國農業科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農業農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081

為創制高甲基化兒茶素茶樹新種質，以金萱和紫娟為親本構建了一個F1代分離群體，并通過建立一種超高效液相色譜法，對群體內各單株的代謝物含量及其遺傳變異情況進行分析。研究發現，群體中多數代謝物含量分布符合正態偏陡分布，變異系數在20%～30%，且均存在一定數量的超親個體，并從中篩選出9份高甲基化兒茶素等富含功能成分的優異單株。同時，結果顯示多數代謝物含量在秋季高于春季，且兒茶素總量隨葉片紫化程度加深而減少。本研究建立的超高效液相色譜法，為今后鑒定和篩選優異茶樹種質資源和育種材料提供了一種更高效的測定方法；對金萱×紫娟F1分離群體生化組分的遺傳變異研究也為今后高功能成分育種和通過正向遺傳學發掘調控相關性狀的基因提供了重要基礎。

茶樹；超高效液相色譜法；F1分離群體；代謝物；遺傳變異

茶樹是我國主要經濟作物之一，富含多種生物活性物質，如茶氨酸、兒茶素、嘌呤生物堿、酚酸、水解單寧等，這些物質對茶樹品質的形成具有重要意義[1-3]。研究發現，當兒茶素發生甲基化后形成以表沒食子兒茶素3--(3--甲基)沒食子酸酯（EGCG3″Me）為主的甲基化兒茶素，除了能夠增加其親脂性外，還具有更明顯的抗過敏、抗氧化、抗癌癥、抗肥胖等生理功能[4-6]。然而富含甲基化兒茶素的茶樹種質資源并不多見，研究人員通過對國內200份茶樹種質的EGCG3″Me含量研究發現，僅有6份種質的EGCG3″Me含量大于1%[7]。此外，呂海鵬等[8]在特異紫化茶樹種質紫娟中也發現了較高含量的EGCG3″Me。Jin等[9]也在一類野生茶樹白芽茶中檢測到較高含量的EGCG3″Me（＞8?mg·g-1）。對日本茶樹品種紅富貴的研究發現，不同季節其甲基化兒茶素含量有所差異，最高含量超過10?mg·g-1[10]。以往研究表明，EGCG3″Me的含量通常在適制烏龍茶品種中較高，因此為了創制高甲基化兒茶素的茶樹資源，本研究以國家種質杭州茶樹圃中的金萱和紫娟分別作為母本和父本，利用人工雜交的方式構建了一個富含甲基化兒茶素的F1分離群體。

對群體中代謝物的研究發現，群體中除甲基化兒茶素外還包含豐富的酚酸和水解丹寧等物質。近年來對茶樹種質資源研究深入，一些栽培種中1,2,6-三沒食子?；咸烟牵═GG）、小木麻黃堿（STR）和茶棓素（TH）的含量也相對較高[11-13]。有些野生茶樹資源還富含如1,2,4,6-四沒食子?；咸烟牵═eGG）和苦茶堿等特異代謝物[14-16]。這些物質不僅是茶湯中重要的滋味成分，而且具有良好的抗菌抗病毒等生理功能[17-18]。然而這些代謝物在以往的研究中多不被重視或被忽略，同時也缺乏一種有效的方法對其進行快速測定。因此，為更全面的對群體中代謝物的變異情況進行分析，需要建立一種能夠分離并檢測這些代謝物的方法。

綜上所述，本研究為了篩選富含STR、TGG、EGCG3″Me等功能成分單株，在建立了一種能快速準確測定這些物質的UPLC技術基礎上，對金萱×紫娟的F1代分離群體中各單株的生化組分及遺傳變異情況進行了研究，并為今后采用正向遺傳學發掘相關功能成分的基因及解析其分子遺傳機制提供表型數據和材料。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

Waters ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀（配有1290 Infinity II高速泵，二極管陣列檢測器，蒸發光散射檢測器，工作站等）（美國Waters公司），RETSCH MM400混合冷凍混合研磨儀（德國Retsch），LABCONCO FreeZone臺式冷凍干燥機（美國LABCONCO）。

1.2 化合物

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）購于上海甄準生物科技有限公司；TH、茶葉堿（TP）和1,3,7-三甲基尿酸（TMUA）購于購美國Sigma公司；EGCG3″Me和表兒茶素3--(3--甲基)沒食子酸酯（ECG3″Me）購于日本Nagara Science公司；表沒食子兒茶素4--(4--甲基)沒食子酸酯（EGCG4″Me）、表兒茶素4--(4--甲基)沒食子酸酯（ECG4″Me）購于北京綠百草科技發展有限公司；可可堿（TB）、苦茶堿（TCR）、STR購于上海源葉科技有限公司；咖啡堿（CAF）購于美國BioVision公司；TGG和1,2,4,6-四沒食子酰基葡萄糖（TeGG）分別由中國農業科學院茶葉研究所韋康研究員和廣東省農業科學院茶葉研究所喬小燕副研究員饋贈；乙腈、甲醇、甲酸等色譜純試劑購于美國Thermofisher公司。

1.3 試驗材料及樣品提取

選取中國農業科學院茶葉研究所國家種質杭州茶樹圃中金萱×紫娟的F1代分離群體132份單株為試驗材料進行研究，其中按新梢第一葉顏色分為綠色、淺紫色、中紫色、深紫色（圖1）。分別采摘2020年春季和秋季第一輪的一芽一葉新梢，迅速放入液氮中固定，利用LABCONCO冷凍干燥機處理4?d至茶葉樣品干透，隨后用RETSCH MM400研磨儀在25～30?r·s-1轉速下研磨1～2?min將樣品磨碎。準確稱取(0.100?0±0.000?3)g磨碎的茶樣加入10?mL的70%甲醇溶液（甲醇∶水=7∶3）超聲30?min，期間每隔15?min上下搖晃5次，將提取液在4℃冰箱靜置2?h后取上清液過0.22?μm有機膜，加入液相瓶中待測，每個樣品均重復測定3次。

1.4 標準曲線的繪制及定量

由于TB在弱堿性條件才能溶解，而堿性條件會影響兒茶素類化合物的穩定性，因此需分別配置生物堿及多酚物質兩種混合標準品。精確稱量TB、TP、CAF、TCR、TMUA、TH、STR、TGG、TeGG、EGCG4″Me、EGCG3″Me、ECG4″Me、ECG3″Me的標準品分別溶于甲醇溶液配置成1?mg·mL-1的母液并繪制標準曲線。同時精確稱取C（1.66?mg）、EC（1.87?mg）、EGC（2.44?mg）、ECG（1.38?mg）、GCG（1.50?mg）、EGCG（2.19?mg），溶于2?mL甲醇后配置成不同濃度梯度的標準溶液，繪制標準曲線。利用外標法對各代謝物進行定量。

注：DP：深紫色。MP：中紫色。LP：淺紫色。G：綠色。下同

1.5 色譜條件

1.5.1 色譜條件的選擇

根據色譜試驗，色譜柱選用美國Waters公司的ACQUITY UPLC HSS T3C18（1.8?μm，2.1?mm×100?mm）柱。檢測波長為280?nm，色譜柱溫度為41℃，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流速為0.4?mL·min-1時，分離效率高，峰形較好。

1.5.2 方法學試驗

儀器精密度測試：選用同一個標準溶液連續進樣5次，根據峰面積計算相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）。重復性測試：稱取同一個樣品6份，按照樣品溶液制備的方法分別測定各物質含量的峰面積，以EGCG、ECG、CAF為代表計算RSD。穩定性測試：量取同一個茶樣品溶液，分別放置不同時間后進行測定，以CAF、EGCG、ECG為代表計算RSD。

1.6 數據處理

利用SPSS 20進行數據統計及分析，利用Kolmogorov-Smirnov法檢驗數據是否符合正態分布，并利用LSD和Duncan法進行假設檢驗。

2 結果與分析

2.1 超高效液相色譜方法的建立

2.1.1 色譜條件的優化

通過調整流動相的配比，最終選擇洗脫梯度為0～6?min，97%A；6～9?min，90%A；9～10?min，87%A；10～14?min，80%A；14～15?min，76%A；15～16?min，97%A；16～18?min，97%A的條件，可獲得最佳分離效果，混合標準樣色譜圖如圖2所示。在之前的研究中，HPLC方法至少需要40?min才能將茶樹中主要代謝物分離完畢[19]。本方法僅需要18?min就能將茶樹中19種不同組分分離完畢，且每次所需溶劑從40?mL縮減至7.2?mL，時間短、效率高。

2.1.2 測定方法的線性關系與檢出限

以標準樣品質量（ng）對峰面積（mV·s）求出線性回歸方程及線性范圍，同時根據信噪比S/N=3，測得各代謝物的檢出限。結果如表1所示，19種物質的回歸方程的回歸系數（2）均大于0.99，表明各個物質的回歸模型均具有顯著性。各組分檢出限在0.09～3.56?ng，表明該測定方法對茶葉中19種代謝物的檢測具有較高的靈敏度。

2.1.3 測定方法的精密度、重復性與穩定性

儀器精密度測試結果顯示，各組分的RSD在0.39%～1.09%，表明儀器精密度良好。重復性和穩定性的測試結果顯示（表2），CAF、EGCG和ECG 3種物質的RSD在0.19%～0.38%，表明樣品的穩定性及重現性良好。

2.1.4 回收率測定

本研究采用標準加入法進行回收率測定，以茶葉中主要化合物為代表計算回收率，結果如表2所示，3種物質的回收率均在93.30%～94.81%，表明本方法回收率良好。

2.2 群體中各代謝物的總體變異情況

經測定發現，F1群體中EGCG4″Me、ECG4″Me、ECG3″Me、TCR、TMUN、TP和TeGG等7種代謝物的含量很低，因此主要對群體中其余的12種代謝物的變異情況進行統計，主要包含2種嘌呤生物堿（TB、CAF），7種兒茶素（C、EC、EGC、ECG、GCG、EGCG、EGCG3″Me），2種水解單寧（STR、TGG）和1種酚酸（TH），結果如表3所示。群體中嘌呤生物堿以CAF含量最高，春秋兩季平均含量分別為35.12?mg·g-1和32.83?mg·g-1，TB在各單株間含量較低，平均含量約為5?mg·g-1。這兩種物質含量均符合正態分布，其中TB含量呈正態偏陡分布，秋茶峰度和偏度較春茶小。群體中各類兒茶素物質的含量差異較大，其中EGCG是最豐富的兒茶素，春秋兩季平均含量分別為93.94?mg·g-1和109.64?mg·g-1，其余兒茶素含量由高到低分別是ECG>EGC>EC>EGCG3″Me>C>GCG。其中C、ECG、EGC、EGCG含量符合正態分布，且多呈正態偏陡分布，而EC、GCG和EGCG3″Me含量不具有正態分布特征（<0.05）。為進一步了解群體中各代謝物含量的變異情況，通過計算F1群體中各代謝物的變異系數來代表群體中各代謝物的變異水平，結果如表3所示。群體中CAF的變異系數最?。?10%），EGCG3″Me的變異系數最高（>71%），其余大多數代謝物的變異系數均保持在20%～30%，多數代謝物的變異系數為秋季大于春季。

研究表明，對于12種代謝物而言，F1群體中均存在一定數量的超雙親個體。EGCG、CAF、EGCG3″Me和STR等4種代表性物質的含量分布如圖3所示，其中CAF含量在群體中變異較小，僅有少部分單株含量高于雙親。但群體中EGCG、STR的含量在部分單株中呈現出明顯的超親優勢，在春秋兩季接近半數單株含量高于親本。EGCG3″Me含量變異較大，含量最高為14.33?mg·g-1。其中春季有82個單株的EGCG3″Me含量高于雙親（3.41?mg·g-1）；秋季有84個單株的EGCG3″Me含量顯著高于金萱（4.43?mg·g-1），有24個單株的超過紫娟（8.55?mg·g-1）；不僅如此，在F1群體中春季有19個單株的EGCG3″Me含量大于高甲基化兒茶素代表資源紅富貴（6.52?mg·g-1），秋季有3個單株的含量高于紅富貴（11.1?mg·g-1），春秋兩季平均值含量高于紅富貴（9.84?mg·g-1）的有9份單株，為高甲基化兒茶素優異新種質。

注：圖A為14種多酚混標色譜圖，1—14分別為茶棓素、表沒食子兒茶素、兒茶素、小木麻黃堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸、1,2,6-三沒食子?；咸烟?、表沒食子兒茶素4-O-(4-O-甲基)沒食子酸酯、表沒食子兒茶素3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、1,2,4,6-四沒食子?；咸烟?、表兒茶素4-O-(4-O-甲基)沒食子酸酯、表兒茶素3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯；圖B為5種嘌呤生物堿混標的色譜圖，15—19分別為可可堿、茶葉堿、三甲基尿酸、苦茶堿、咖啡堿；圖C為茶葉樣品分離色譜圖，分離物質1—12分別為茶棓素、可可堿、表沒食子兒茶素、兒茶素、咖啡堿、小木麻黃堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸、1,2,6-三沒食子?；咸烟恰⒈頉]食子兒茶素3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯

2.3 基于UPLC方法對群體季節性及葉色變異分析

F1群體中不同季節和葉色的代謝物存在差異（表3）。其中CAF含量在不同季節有顯著性差異（<0.05），春季含量顯著高于秋季。兒茶素作為茶樹中最重要的成分之一受季節影響十分明顯，除ECG外其他兒茶素秋茶含量均顯著高于春茶。TGG和STR在春季的含量顯著高于秋季，而TH在秋季的含量顯著高于春季。研究發現，F1群體不同顏色的葉片中各代謝物的含量有所差異（表4），其中CAF、TH、EGCG3″Me在不同葉色間含量差異較小，TGG和STR兩種代謝物在不同顏色葉片間有一定差異，但無明顯規律。兒茶素類代謝物在不同顏色葉片中變異明顯，其中C、ECG、EGC、EGCG的含量在不同葉色間差異顯著，且隨紫化程度加深而減少。本研究還進一步分析了總兒茶素含量與葉片顏色間的關系，結果如圖4所示。整體上，在春秋兩個季節綠色葉片中的總兒茶素含量明顯高于紫色葉片，且隨紫化程度的增加總兒茶素含量顯著減少。以EGCG3″Me為標準，共篩選出9份高甲基化兒茶素的單株，其中綠色4份、淺紫色3份、中紫色2份，含量均高于甲基化兒茶素代表資源紅富貴（表5）。

表1 茶葉中19種代謝物的線性方程及方法檢出限

表2 茶葉主要化合物穩定性重復性及加樣回收率的測定

注：表中數據為3次重復的平均值±標準差，下同

Note: Data are means±SD of three replicates, the same below

注：JX、ZJ分別為群體中的親本金萱和紫娟，BFK為高甲基化兒茶素茶樹資源紅富貴

注：圖上不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

表3 2020年親本及F1群體各代謝物含量

Table 3 Metabolite contents of parents and F1population in 2020

注：TH茶棓素；TB可可堿；EGC表沒食子兒茶素；C兒茶素；CAF咖啡堿；STR小木麻黃堿；EC表兒茶素；EGCG表沒食子兒茶素沒食子酸酯；GCG沒食子兒茶素沒食子酸酯；ECG表兒茶素沒食子酸酯；TGG三沒食子?；咸烟牵籈GCG3″Me表沒食子兒茶素3--(3--甲基)沒食子酸酯；n.d.指未檢測出，下同。利用Kolmogorov-Smirnov法檢驗數據是否符合正態分布，不同季節中小寫字母表示在<0.05水平差異顯著

Note: TH, theogallin. TB, theobromine. EGC, epigallocatechin. C, catechin. TCR, theacrine. CAF, caffeine. STR, strictinin. EC, epicatechin. EGCG, epigallocatechin gallate. GCG, gallocatechin gallate. ECG, epicatechin gallate. TGG, 1,2,6-Tetra--galloyl-β-D-glucose. EGCG3″Me, 3″-methyl-epigallocatechin gallate. n.d. means not detected, the same below. Kolmogorov-smirnov method is used to test whether the data conform to normal distribution. Small letters in different seasons indicate significant difference at<0.05 level

表4 2020年春秋兩季4種顏色類型的代謝物含量

注：春秋季綠、淺紫、中紫、深紫的數量分別為40、37、23、32和39、40、18、35。同一季節同行中的小寫字母表示在<0.05水平差異顯著

Note: The quantities of green, light purple, medium purple and deep purple in spring and autumn are 40, 37, 23, 32 and 39, 40, 18, 35 respectively. Different lowercase letters in the same season indicate significant difference at<0.05

表5 2020年F1群體中優勢單株的EGCG3"Me含量

3 討論

我國是茶樹種質資源最豐富的國家，這些茶樹資源富含多種生物活性物質。然而在部分資源中有些物質雖然含量較高，但并未引起足夠的重視。本研究建立了一種能夠在18?min內分離茶葉中19種代謝物的超高效液相色譜法，穩定性和重復性試驗結果表明其同時擁有較高的靈敏度和較好的重現性。該方法簡單高效，能夠在短時間內對茶葉中主要物質進行分離定量，不僅適用于栽培茶樹常規組分的測定，同時還能對一些特異資源中所含甲基化兒茶素、TCR及TeGG等代謝物進行測定。

以金萱×紫娟的F1代分離群體為研究材料，利用該方法對群體中各組分進行分離及測定，研究表明群體中最豐富的代謝物是EGCG，其次是CAF，多數代謝物含量分布符合正態偏陡分布，秋季的峰度較春季高。對群體中各代謝物的變異情況研究顯示，EGCG3″Me的變異水平最高，CAF的變異水平最低，其余多數物質變異系數多在20%～30%。各代謝物受季節變化影響明顯，其中生物堿、TGG、STR的含量在春季顯著高于秋季，而TH和大部分兒茶素的含量為秋季顯著高于春季。導致這些代謝物呈現季節性變異可能與不同季節的環境因素有關（溫度、濕度和光照）。有研究發現，與春季相比，秋季的光照時間長、強度大、光合作用效率高，因此富含更多兒茶素[20]。

甲基化兒茶素作為一種特殊的兒茶素，經證實其穩定性和吸收利用率遠高于普通兒茶素。研究表明，茶樹通常以-腺苷-甲硫氨酸（-adenosyl--methionine，SAM）作為甲基的供體，在甲基轉移酶的催化下將甲基轉移到兒茶素的酚羥基上，進而合成甲基化兒茶素[21]。目前已有研究人員利用含甲基化兒茶素的茶樹品種克隆出甲基化兒茶素合成酶基因，通過原核表達的方式最終獲得了甲基化兒茶素化合物[22-23]。對群體中各代謝物的研究發現，部分代謝物在群體中呈現明顯的超親優勢，其中EGCG3″Me的含量變異最大，春秋兩季有近半數資源的含量超過雙親。最終，本研究共篩選出9份高EGCG3″Me的優異單株，其平均含量超過高甲基化兒茶素的代表性品種紅富貴，將為后續選育高甲基化兒茶素新品種提供材料基礎。

茶樹葉色是不同茶樹品種間重要的差異性狀，其中花青素的積累是芽葉呈紫色的主要因素[24]。本研究發現，F1群體中兒茶素的含量在不同葉色的單株間呈現出顯著差異，隨紫化程度增加而減少。這可能是由于在花青素與兒茶素合成的過程中需要相同的前體物質查爾酮，且都需要無色矢車菊素和無色飛燕草素的轉化，二者在合成過程中存在一定的競爭關系所導致，最終在群體中呈現出一定的葉色變異特征[25]。

綜上所述，為創制高甲基化兒茶素新種質，本研究以金萱和紫娟為親本構建了一個F1代分離群體，基于超高效液相色譜技術，建立了一種能夠在較短時間內分離茶樹中19種不同代謝物的方法。分析發現，F1分離群體中多數代謝物符合正態分布，且受季節和不同葉色顯著影響。多數代謝物的含量為秋茶高于春茶，總兒茶素含量隨葉片紫化程度增加而減少。通過對群體中所有單株的甲基化兒茶素進行測定，共篩選出9份高甲基化兒茶素的超親單株，為今后發掘高甲基化兒茶素的關鍵基因及品種選育奠定了重要基礎。

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The Genetic Variation of the Chemical Components of the ‘Jinxuan’בZijuan’ F1Segregating Population Based on UPLC

LIU Qingshuai1,2, QU Furong1,2, WEI Mengyuan1, ZHONG Hong1,2, WANG Yi1,2, CHEN Liang1, JIN Jiqiang1*

1. Tea Research Institute of the Chinese of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing 100081, China

In order to innovate new germplasms with high methylated catechins, a F1segregating population was constructed with ‘Jinxuan’ and ‘Zijuan’ as parents. At the same time, an ultra-high performance liquid chromatography method was established to analyze the metabolite content and genetic variation of individual plants in the population. Our study found that most metabolites conformed to the normal and slightly steep distribution. The coefficient of variations were between 20% and 30%. There was a clear heterosis and several individual plants rich in methylated catechins were selected from the population. It also found that the contents of most metabolites in autumn were higher than those in spring, and the amount of total catechins decreased with the purple degree of leaves. The UPLC technology established in this study would provide a more efficient determination method for the future identification and screening of elite tea germplasms and breeding materials. The genetic variation of the chemical components of the ‘Jinxuan’ בZijuan’ F1segregating population identified in this study also provided an important foundation for the high functional component breeding and discovery of genes governing traits through forward genetics.

tea, ultra high performance liquid chromatography, F1population, metabolites, genetic variation

S571.1

A

1000-369X(2022)01-029-12

2021-10-09

2021-11-12

浙江省自然科學基金（LZ22C160008）、國家自然科學基金（31670685）、中國農業科學院科技創新工程（CAASASTIP-2017-TRICAAS）、財政部和農業農村部：現代農業產業技術體系（CARS-19）、中央科研院所基本科研業務費（1610212018008）

劉慶帥，男，碩士研究生，主要從事茶樹資源育種與遺傳改良研究。*通信作者：xyjjq@tricaas.com

（責任編輯：黃晨）