茯磚茶改善2型糖尿病小鼠代謝紊亂的效果研究

代昕玥，葛炳鋼，張旭雯，劉文武，段繼春，傅冬和,3*

茯磚茶改善2型糖尿病小鼠代謝紊亂的效果研究

代昕玥1,2，葛炳鋼1,2，張旭雯1,2，劉文武1,4，段繼春5，傅冬和1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；5. 湖南德康茶業(yè)科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410001

為探究茯磚茶能否通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群改善2型糖尿病（T2DM）的代謝紊亂，建立T2DM小鼠模型，給予400?mg·kg-1茯磚茶水提取物灌胃干預(yù)，觀測(cè)T2DM小鼠的飲食量、飲水量、空腹體重、空腹血糖、糖耐量等日常指標(biāo)，血清中胰島素（INS）、總膽汁酸（TBA）、總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-（TNF-）水平，以及胰腺、回腸的病理學(xué)變化，并對(duì)小鼠糞便進(jìn)行了腸道菌群16?SrRNA測(cè)序。結(jié)果顯示，茯磚茶顯著改善了小鼠的糖脂代謝紊亂和炎癥，明顯修復(fù)了T2DM導(dǎo)致的胰腺和回腸損傷。茯磚茶能顯著降低T2DM引起的疣微菌門(mén)相對(duì)豐度異常增加，恢復(fù)腸道微生物群多樣性。茯磚茶能增加腸道厚壁菌門(mén)、、腸桿菌屬、、雙歧桿菌屬、、、、及等有益菌，說(shuō)明茯磚茶可通過(guò)增加腸道有益菌群，調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而改善T2DM的代謝紊亂。

茯磚茶；2型糖尿病；腸道菌群

2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以高血糖和代謝紊亂為特征的疾病[1]，其發(fā)病率在不斷上升，給醫(yī)療服務(wù)帶來(lái)越來(lái)越大的負(fù)擔(dān)。據(jù)糖尿病國(guó)際聯(lián)盟（IDF）估計(jì)，到2045年，將有6.93億人受到T2DM的影響[2]。T2DM會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂，持續(xù)的腸道菌群失調(diào)又將導(dǎo)致T2DM的惡性發(fā)展，因此，調(diào)節(jié)腸道菌群是防治T2DM的有效措施。在健康的腸道微生物群遭到破壞時(shí)，補(bǔ)充刺激消化道有益細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)（益生元）是一種有效的治療方法[3-4]。近年來(lái)，茶水提取物已被證實(shí)可作用于腸道菌群，可能具有益生元的潛力。綠茶茶湯可降低高脂小鼠腸道中厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比例[5]；青磚茶水提取物能增加正常小鼠腸道中乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌[6]；普洱茶水提取物可顯著改善非酒精性脂肪肝導(dǎo)致的腸道菌群紊亂[7]；武夷巖茶水提取物可有效改善糖尿病導(dǎo)致的腸道菌群紊亂[8]。此外，烏龍茶、紅茶和綠茶水提取物也可調(diào)節(jié)肥胖小鼠的腸道菌群紊亂，增加與降脂有關(guān)的有益菌群[9]。

茯磚茶（Fu brick tea）是一種具有多種活性成分的黑茶[10]，其水提取物可改善T2DM小鼠糖脂代謝紊亂[11]，并可有效調(diào)節(jié)高脂小鼠的腸道菌群紊亂[12]。已有研究報(bào)道茯磚茶在體外可促進(jìn)腸道菌群有益菌生長(zhǎng)[13]，但鮮見(jiàn)關(guān)于茯磚茶對(duì)T2DM小鼠腸道菌群失調(diào)的研究。本研究擬通過(guò)高脂高糖飼料聯(lián)合鏈脲佐霉素（Streptozocin，STZ）建立T2DM小鼠模型，通過(guò)茯磚茶干預(yù)，探討茯磚茶是否能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群改善T2DM的代謝紊亂，為進(jìn)一步研究茯磚茶改善T2DM提供更多證據(jù)，以期促進(jìn)茯磚茶功能成分的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

茯磚茶樣品（2016年生產(chǎn)）由長(zhǎng)沙德康生物科技有限公司提供；鏈脲佐霉素購(gòu)自美國(guó)sigma公司；普通維持飼料及高脂高糖飼料（65%大小鼠維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鈉+1%礦物質(zhì)混合物+0.5%纖維素混合物）均購(gòu)自北京博愛(ài)港生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

Hettich MIKRO-22R低溫高速離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；穩(wěn)擇易型血糖儀，強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司；病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；石蠟包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司。

1.3 茯磚茶成分檢測(cè)及提取

茯磚茶粉碎過(guò)12目篩，用沸水浸提兩次（茶水比1∶10），過(guò)濾合并濾液，減壓真空濃縮后真空冷凍干燥，得到水提取物凍干粉。茯磚茶水提取物凍干粉的可溶性糖通過(guò)硫酸蒽酮法測(cè)定[14]、黃酮采用三氯化鋁比色法測(cè)定[15]、多酚采用福林酚法測(cè)定[16]。茯磚茶凍干粉中可溶性糖含量為(22.27±1.33)%，多酚含量為(16.47±1.14)%，黃酮類化合物含量為(7.74±0.46)%。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

30只體質(zhì)量為(13.0±2.0)g的3周齡昆明雄性小鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23～25℃，12?h明暗交替。所有小鼠均自由飲食，經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，10只小鼠被隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control），喂養(yǎng)普通飼料。其他20只小鼠被分為造模組，進(jìn)行4周高脂高糖飲食（35%脂肪，50%碳水化合物，15%蛋白質(zhì)）喂養(yǎng)。4周后，造模組小鼠在隔夜禁食16?h后，腹腔注射SZT溶液（120?mg·kg-1，檸檬酸緩沖液為溶劑，pH 4.2～4.5）。正常對(duì)照組小鼠注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。3?d后，通過(guò)尾靜脈采血，用血糖儀檢測(cè)禁食8?h后的血糖（FBG）。具有FBG≥11.1?mmol·L-1并維持3?d的小鼠被認(rèn)為是T2DM小鼠[17]。將20只T2DM小鼠隨機(jī)分為模型組（Model）和茯磚茶組（FBT）。對(duì)照組和模型組的小鼠每天灌胃補(bǔ)充0.3?mL蒸餾水。茯磚茶組小鼠每天灌胃茯磚茶水提取物（400?mg·kg-1），劑量參照文獻(xiàn)[11-12]（按黑茶每天推薦量10?g計(jì)算，本研究采用劑量相當(dāng)于人體推薦飲茶量9倍）。T2DM小鼠在試驗(yàn)結(jié)束前一直以高脂高糖飲食喂養(yǎng)。在茯磚茶灌胃干預(yù)期間，每天記錄飲水量和飲食量，每周記錄體重和空腹血糖。經(jīng)過(guò)4周茯磚茶干預(yù)后，采集小鼠糞便樣本。所有小鼠在隔夜禁食后用4%水合氯醛麻醉解剖。收集血液、胰腺和回腸供進(jìn)一步分析，并將胰腺和回腸組織固定在4%多聚甲醛中。

1.5 腹腔內(nèi)葡萄糖耐受性測(cè)試（IPGTT）

在小鼠白天禁食8?h后，測(cè)定第0?h空腹血糖，然后通過(guò)腹腔注射劑量為2?g·kg-1的葡萄糖，在葡萄糖處理后0.5、1?h和2?h分別測(cè)定血糖值，并計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）[18]。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)

血液樣品在4℃下，2?500?r·min-1離心10?min，收集血清。按照酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）說(shuō)明書(shū)要求，測(cè)定小鼠血清中白介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、胰島素（INS）含量；按照生化試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定小鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂肪蛋白（LDL-C）、高密度脂肪蛋白（HDL-C）及總膽汁酸（TBA）含量。胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估計(jì)算，計(jì)算公式為：HOMA-IR=[空腹血清胰島素含量×空腹血糖（FBG）]÷22.5。

1.7 病理切片制作

小鼠胰腺和回腸組織固定24?h，按以下步驟進(jìn)行石蠟切片制作及蘇木精-伊紅（H＆E）染色：（1）將組織在75%、80%、85%、90%、95%和100%濃度梯度酒精中脫水，然后放入醇苯溶液及二甲苯溶液，至組織呈透明狀態(tài)；（2）將透明的組織浸蠟包埋切片，切片厚度為4?μm；（3）依次將切片放入二甲苯溶液和100%、95%、90%、85%、80%、75%濃度梯度酒精溶液中脫蠟，然后水洗；（4）蘇木素染色：組織切片放入蘇木素染液染色，水洗后放入鹽酸酒精分化，然后流水沖洗；（5）伊紅染色：將沖洗好的組織切片依次放入85%、90%、95%濃度梯度的酒精脫水，然后放入伊紅染液中染色；（6）脫水封片：切片依次放入無(wú)水乙醇脫水，放入二甲苯中透明，中性樹(shù)膠封片；（7）顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.8 腸道菌群16?SrRNA測(cè)序

提取小鼠糞便樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5'-CCTACGGG NGGCWGCCAG-3'，下游引物序列為5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列。測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.9 數(shù)據(jù)分析

16?S rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)使用BMKCloud（www.biocloud.net）進(jìn)行分析。數(shù)值通過(guò)平均數(shù)±平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）或平均數(shù)表示，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較各組之間的差異，<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有其他分析均使用SPSS 23.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶對(duì)T2DM小鼠糖代謝的改善作用

T2DM小鼠血糖的測(cè)定結(jié)果如表1和圖1所示。與對(duì)照組相比，T2DM小鼠體重顯著減少，飲食量和飲水量顯著增加（<0.05），空腹血糖也顯著增加（<0.05），表現(xiàn)出明顯的“三多一少”癥狀；IPGTT結(jié)果顯示，T2DM小鼠糖耐量顯著受損，胰島素抵抗指數(shù)顯著提高（<0.05）。胰腺病理結(jié)果顯示，T2DM小鼠胰島出現(xiàn)了嚴(yán)重的萎縮變形及炎性浸潤(rùn)。與模型組相比，茯磚茶干預(yù)顯著改善了T2DM小鼠“三多一少”的癥狀（<0.05）。此外，在茯磚茶干預(yù)下，T2DM小鼠胰島素抵抗指數(shù)和糖耐量得到了改善（<0.05），胰島萎縮變形和炎性浸潤(rùn)的程度減輕。這些結(jié)果表明，茯磚茶有效改善了小鼠T2DM的癥狀，抑制了T2DM病理指標(biāo)的發(fā)展。

2.2 茯磚茶對(duì)T2DM小鼠血清TBA及血脂的影響

各組小鼠的血清TBA和血脂指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組血清TBA水平顯著升高，而茯磚茶組血清TBA水平與模型組相比顯著降低（<0.05），與對(duì)照組無(wú)顯著差異。與對(duì)照組相比，模型組血脂異常，TG、TC、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低（<0.05）；與模型組相比，茯磚茶干預(yù)后的T2DM小鼠血脂的各項(xiàng)指標(biāo)都得到了顯著的改善（<0.05）。結(jié)果說(shuō)明，茯磚茶在一定程度改善了T2DM小鼠脂質(zhì)代謝紊亂。

2.3 茯磚茶對(duì)T2DM小鼠炎性因子及回腸黏膜損傷的影響

茯磚茶對(duì)T2DM小鼠炎性因子的影響結(jié)果如圖2-A和2-B所示，回腸病理學(xué)變化如圖2-C所示。T2DM導(dǎo)致血清炎性因子IL-1和TNF-水平顯著升高，與模型組相比，茯磚茶顯著降低了炎性因子水平（<0.05）。回腸病理結(jié)果顯示，T2DM導(dǎo)致部分回腸絨毛脫落斷裂，黏膜完整性遭到破壞，而茯磚茶干預(yù)減輕了回腸黏膜損傷，保護(hù)了其結(jié)構(gòu)完整性。說(shuō)明茯磚茶緩解了機(jī)體炎癥，修復(fù)了回腸黏膜損傷。

表1 4周干預(yù)期內(nèi)各組小鼠日常指標(biāo)記錄

注：*表示與對(duì)照組相比，差異顯著（<0.05）；#表示與模型組相比，差異顯著（<0.05）

Note: * represents a significant difference compared to the control group,<0.05. # represents a significant difference compared to the model group,<0.05

注：A 為IPGTT血糖曲線；B為血糖曲線下面積；C為胰島抵抗指數(shù)；D為小鼠胰腺病理學(xué)變化（黑色箭頭表示胰島）；*表示與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.05）；#表示與模型組相比，差異顯著（P<0.05）

表2 4周干預(yù)后小鼠總膽汁酸和血脂指標(biāo)的含量

注：*表示與對(duì)照組相比，差異顯著（<0.05）；#表示與模型組相比，差異顯著（<0.05）

Note: * represents a significant difference compared to the control group,<0.05. # represents a significant difference compared to the model group,<0.05

2.4 茯磚茶對(duì)T2DM小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

2.4.1微生物多樣性分析

通過(guò)對(duì)小鼠糞便進(jìn)行腸道細(xì)菌16?S rRNA高通量測(cè)序分析，研究茯磚茶對(duì)T2DM引起的腸道菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)作用。基于香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)評(píng)估腸道微生物群落的多樣性（圖3-A和3-B）。與對(duì)照組相比，模型組香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)顯著降低（<0.05），表明微生物群落多樣性較低。相對(duì)于模型組，茯磚茶處理顯著提高了香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)（<0.05），甚至略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異。基于主坐標(biāo)分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）和相似性分析探究腸道微生物群落的多樣性（圖3-C和3-D），發(fā)現(xiàn)T2DM模型組的腸道微生物群與對(duì)照組明顯不同，茯磚茶干預(yù)后小鼠腸道菌群較接近對(duì)照組。這表明茯磚茶可基本恢復(fù)由T2DM誘導(dǎo)的低腸道微生物群落多樣性，促進(jìn)失調(diào)腸道微生物群良性發(fā)展。

注：*表示與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.05）；#表示與模型組相比，差異顯著（P<0.05）

2.4.2物種分類及差異性分析

為了解腸道微生物群的具體變化，繪制了在門(mén)水平上的豐度分布圖（圖4-A）。與Cao等[19]研究結(jié)果相似，擬桿菌門(mén)（）、厚壁菌門(mén)（）是小鼠腸道微生物群的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。T2DM在門(mén)水平上引起了腸道微生物群組成和結(jié)構(gòu)的較大變化。模型組擬桿菌門(mén)比對(duì)照組相對(duì)豐度減少約10%，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度變化不大，螺旋體菌門(mén)（），疣微菌門(mén)（）相對(duì)豐度隨著擬桿菌門(mén)的減少而升高（圖4-A和表3）。與模型組相比，茯磚茶組厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度增加約13%，疣微菌門(mén)豐度顯著降低。厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)（F/B）的比值在T2DM患者中通常會(huì)降低[20]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組和模型組相比，茯磚茶組的F/B值升高，但不存在顯著差異（圖4-C）。總之，T2DM導(dǎo)致了腸道菌群失調(diào)，而茯磚茶干預(yù)改善了腸道菌群的紊亂，使腸道微生物組成更接近于對(duì)照組小鼠（圖4-B）。

如圖4-D所示，豐度分布圖顯示了排名前十的屬。通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，T2DM導(dǎo)致疣微菌門(mén)的阿克曼菌屬（）的相對(duì)豐度顯著增加（表3）。有報(bào)道稱阿克曼屬是有益菌屬，但其過(guò)量定植于腸道，可能會(huì)引起腸道黏膜受損，進(jìn)而加重腸道菌群失調(diào)[21]。與模型組相比，茯磚茶組的阿克曼屬、的相對(duì)豐度顯著降低，、、巨單胞菌屬（）、等菌屬的豐度顯著增加。

注：表示與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.05）；#表示與模型組相比，差異顯著（P<0.05）；o表示離群值

2.4.3 LEfSe組間顯著性差異分析

通過(guò)LEfSe（LDA≥3）分類級(jí)別為門(mén)到屬，闡明茯磚茶干預(yù)后細(xì)菌的具體變化（圖5）。茯磚茶的生物標(biāo)志物包括放線菌綱（）、雙歧桿菌科（）、雙歧桿菌目（）、雙歧桿菌屬（）、腸桿菌屬（）、柯林斯菌屬（）、紅蝽?xiàng)U菌科（）及，擬桿菌門(mén)，厚壁菌門(mén)毛螺菌科A2、、，厚壁菌門(mén)瘤胃球菌、，厚壁菌門(mén)丹毒絲菌綱（）、丹毒絲菌科（）、丹毒絲菌目（），及。

注：ns表示無(wú)顯著差異（P＞0.05）；*表示與對(duì)照組相比，差異顯著（P＜0.05）；#表示與模型組相比，差異顯著（P＜0.05）

3 討論

研究表明，茯磚茶可改善T2DM小鼠糖脂代謝紊亂，并具有劑量依賴性[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，劑量為400?mg·kg-1的茯磚茶水提取物有效改善了T2DM引起的糖脂代謝紊亂及炎癥，對(duì)T2DM代謝紊亂的改善可能與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。

3.1 茯磚茶可調(diào)節(jié)腸道微生物群落組成，改善T2DM小鼠腸道菌群失調(diào)

如和多樣性分析所示，茯磚茶改變了T2DM小鼠的腸道菌群組成，改善了T2DM所導(dǎo)致的低微生物多樣性，使微生物群落組成接近對(duì)照組。如圖4-A和5-A所示，T2DM模型組疣微菌門(mén)異常增加，與Salguero等[22]研究結(jié)果一致。該菌門(mén)唯一鑒定出的菌屬為阿克曼菌屬，全稱為嗜黏蛋白阿克曼菌，以腸道黏蛋白作為唯一碳源生長(zhǎng)[23]。其過(guò)量定植于腸道會(huì)導(dǎo)致腸道黏蛋白的過(guò)度消耗，導(dǎo)致腸道損傷[24]。其產(chǎn)物丙酸鹽的過(guò)量將導(dǎo)致胰島素抵抗和葡萄糖不耐受[25]，增加患T2DM風(fēng)險(xiǎn)[26]。因此，茯磚茶可能通過(guò)降低T2DM小鼠中異常表達(dá)的腸道菌群豐度，基本恢復(fù)正常的菌群組成，改善T2DM小鼠腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而抑制T2DM病情的發(fā)展。

表3 基于門(mén)和屬水平的多元統(tǒng)計(jì)ANOVA分析

注：*表示與對(duì)照組相比，差異顯著（<0.05）；#表示與模型組相比，差異顯著（<0.05）

Note: * represents a significant difference compared to the control group,<0.05. # represents a significant difference compared to the model group,<0.05

3.2 茯磚茶可能通過(guò)增加有益菌屬，改善T2DM小鼠代謝紊亂

茯磚茶通過(guò)增加有益菌屬，以減輕T2DM誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)，基本恢復(fù)了腸道健康，進(jìn)而改善T2DM代謝紊亂。本研究顯示，T2DM導(dǎo)致了普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬的豐度降低，這與已有報(bào)道一致[27-29]。茯磚茶干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了這種變化，初步表明了其可能有作為益生元的潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶干預(yù)可顯著改善T2DM導(dǎo)致的體重下降，這可能與腸道菌群厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度的增加有關(guān)。部分T2DM患者出現(xiàn)體重減輕的情況，這主要由于其血糖不能得到良好利用，轉(zhuǎn)而利用脂肪，導(dǎo)致其機(jī)體消瘦。厚壁菌門(mén)具有比擬桿菌更高的食物熱量攝取的能力[30]，可以補(bǔ)充機(jī)體消耗的脂肪，使機(jī)體能量循環(huán)趨于正常。在模型組中沒(méi)有觀察到F/B指數(shù)下降，這可能是由于小鼠個(gè)體差異，本研究使用的正常小鼠的腸道菌群的最優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌門(mén)，與其他研究的厚壁菌門(mén)為最優(yōu)勢(shì)菌不同。與模型組相比，茯磚茶組的厚壁菌門(mén)豐度增加了約15%，這可能是茯磚茶改善T2DM小鼠體重減輕的原因之一。

LEfSe分析表明，在茯磚茶富集的有益菌群中，產(chǎn)丁酸細(xì)菌增多，如、和[31]。研究表明，T2DM患者腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)丁酸的細(xì)菌會(huì)減少。丁酸鹽具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，有益于腸道黏膜完整性[32]。腸黏膜的破壞會(huì)加劇腸道菌群紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂。因此適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)丁酸鹽產(chǎn)生，有益于腸黏膜結(jié)構(gòu)完整和抗炎。但在本研究中，T2DM小鼠腸道中阿克曼菌屬的異常增加，可能會(huì)促進(jìn)產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度增加[23]。茯磚茶干預(yù)顯著降低了阿克曼菌屬的豐度，可能促進(jìn)了另一些產(chǎn)丁酸的有益菌增加，只提供適量的丁酸鹽，使腸道菌群的代謝逐漸恢復(fù)正常。此外，茯磚茶富集的豐度增加可能及時(shí)補(bǔ)充了阿克曼菌屬過(guò)度消耗的黏蛋白，保護(hù)了腸道黏膜結(jié)構(gòu)[33]。這表明茯磚茶富集的有益菌群，可能有利于改善機(jī)體炎癥與腸道黏膜損傷。本研究結(jié)果顯示，茯磚茶減輕了由T2DM導(dǎo)致的炎癥及回腸黏膜損傷，初步驗(yàn)證了這一推論。

研究也發(fā)現(xiàn)茯磚茶富集了一些與膽汁酸代謝相關(guān)的菌群，如[34][35][36]、雙歧桿菌屬[37]、[38]和[39]。膽汁酸的產(chǎn)生和代謝需要腸道菌群的參與。腸道菌群紊亂將干擾膽汁酸代謝，從而導(dǎo)致代謝紊亂[40]。膽汁酸可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，可能是腸道菌群調(diào)節(jié)T2DM脂質(zhì)代謝紊亂的途徑之一[41]。茯磚茶可能通過(guò)促進(jìn)這些有益菌生長(zhǎng)，減輕T2DM導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)，茯磚茶干預(yù)改善了T2DM小鼠血脂水平，且總膽汁酸水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異，這一結(jié)果與此推斷相符。

注：A為L(zhǎng)EfSe分析進(jìn)化分枝圖；B為L(zhǎng)DA值分布的直方圖（LDA≥3）

茯磚茶還富集了一些潛在的有益菌，如[42]，[43]等。然而，茯磚茶也富集了[44]等與T2DM風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)的菌群，這也提示茯磚茶作為飲料，其作用是有限的，但符合試驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，茯磚茶具有作為益生元的潛力，其干預(yù)可能通過(guò)增加有益菌群調(diào)節(jié)T2DM導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而改善T2DM及其相關(guān)代謝紊亂，這為進(jìn)一步研究茯磚茶改善T2DM及其代謝紊亂提供了新的證據(jù)。同時(shí)，本研究也存在不足之處，小鼠個(gè)體差異較大，T2DM病癥復(fù)雜，本研究?jī)H能代表部分2型糖尿病癥狀。

[1] Chen L, Magliano D J, Zimmet P Z. The worldwide epidemiology of type 2 diabetes mellitus-present and future perspectives [J]. Nature Reviews Endocrinology, 2012, 8(4): 228-236.

[2] Cho N H, Shaw J E, Karuranga S, et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045 [J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 2018, 138: 271-281.

[3] Martin R, Langella P. Emerging health concepts in the probiotics field: streamlining the definitions [J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 1047. doi: 10.3389/fmicb.2019.01047.

[4] Zhao L P, Zhang F, Ding X Y, et al. Gut bacteria selectively promoted by dietary fibers alleviate type 2 diabetes [J]. Science, 2018, 359(6380): 1151-1156.

[5] 郭虹雯, 許翔雨, 陳瑩婕, 等. 綠茶茶湯對(duì)肥胖相關(guān)腸道菌群的影響[J]. 茶葉科學(xué), 2016, 36(4): 354-362.

Guo H W, Xu X Y, Chen Y J, et al. Effect of green tea infusions on obesity-associated gut microbiota [J]. Jornal of Tea Science, 2016, 36(4): 354-362.

[6] 唐飛, 艾于杰, 張善明, 等. 不同年份青磚茶改善小鼠胃腸道功能的研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 37(1): 82-88.

Tang F, Ai Y J, Zhang S M, et al. Effect of storage time of dark brick tea on improving gasintestinal function in mice [J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2018, 37(1): 82-88.

[7] 路曉杰, 劉久茜, 曹永國(guó), 等. 普洱熟茶提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪肝鼠脂代謝指標(biāo)及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2018, 38(4): 751-758.

Lu X J, Liu J X, Cao Y G, et al. Pu-er extrat modulating lipid metabolism and gut microbiota in fatty liver disease mice [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2018, 38(4): 751-758.

[8] 馬玉仙, 蔣慧穎, 曾文治, 等. 武夷巖茶對(duì)糖尿病大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 48(1): 22-27.

Ma Y X, Jiang H Y, Zeng W Z, et al. Regulatory effect of Wuyi rock tea on intestinal bacteria in diabetic rat [J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), 2019, 48(1): 22-27.

[9] Liu Z B, Chen Z C, Guo H W, et al. The modulatory effect of infusions of green tea, oolong tea, and black tea on gut microbiota in high-fat-induced obese mice [J]. Food & Function, 2016, 7(12): 4869-4879.

[10] 傅冬和, 劉仲華, 黃建安, 等. 茯磚茶加工過(guò)程中主要化學(xué)成分的變化[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(2): 64-67.

Fu D H, Liu Z H, Huang J A, et al. Variations of components of Fuzhuan tea during processing [J]. Food Science, 2008, 29(2): 64-67.

[11] 黃頌, 劉仲華, 黃建安, 等. 茯茶水提物對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠糖代謝紊亂的干預(yù)作用[J]. 茶葉科學(xué), 2016, 36(3): 250-260.

Huang S, Liu Z H, Huang J A, et al. Intervention effects of Fuzhuan brick tea water extract on glucose metabolism disorder in a mouse model of type Ⅱdiabetes mellitus [J]. Jornal of Tea Science, 2016, 36(3): 250-260.

[12] Liu D, Huang J, Luo Y, et al. Fuzhuan brick tea attenuates high-fat diet-induced obesity and associated metabolic disorders by shaping gut microbiota [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(49): 13589-13604.

[13] 侯愛(ài)香, 顏道民, 孫靜文, 等. 綠茶、紅茶和茯磚茶水提物對(duì)腸道微生物體外發(fā)酵特性的影響[J]. 茶葉科學(xué), 2019, 39(4): 403-414.

Hou A X, Yan D M, Sun J W, et al. Effects of green, black and Fu brick tea aqueous extracts on the characteristics of intestinal microbiota duringfermentation [J]. Jornal of Tea Science, 2019, 39(4): 403-414.

[14] 王黎明, 夏文水. 蒽酮-硫酸法測(cè)定茶多糖含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(7): 185-188.

Wang L M, Xia W S. Determination of TPS by improvement of anthrone-sulfuric acid method [J]. Food Science, 2005, 26(7): 185-188.

[15] Uaman H, Ullah M A, Jan H, et al. Interactive effects of wide-spectrum monochromatic lights on phytochemical production, antioxidant and biological activities ofcallus cultures [J]. Molecules, 2020, 25(9): 2201. doi: 10.3390/molecules25092201.

[16] 游見(jiàn)明, 曹新志. 福林酚法測(cè)定茶樹(shù)中茶多酚的分布水平[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 52(10): 2417-2419.

You J M, Cao X Z. Analysis on the distribution of tea polyphenol in tea tree by Folin-Ciocalteaut method [J]. Hubei Agricultural Science, 2013, 52(10): 2417-2419.

[17] Bhate A, Parker D J, Bebee T W, et al. ESRP2 controls an adult splicing programme in hepatocytes to support postnatal liver maturation [J]. Nature Communications, 2015, 6: 8768. doi: 10.1038/ncomms9768.

[18] 栗志文, 王媛媛, 王根輩, 等. 普洱茶提取物與綠茶提取物降糖功效的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(5): 428-434.

Li Z W, Wang Y Y, Wang G B, et al. Study of the hypoglycemic effect of Pu′er tea and green tea extracts [J]. Jornal of Tea Science, 2014, 34(5): 428-434.

[19] Cao Y, Yao G, Sheng Y, et al. JinQi jiangtang tablet regulates gut microbiota and improve insulin sensitivity in type 2 diabetes mice [J]. Journal of Diabetes Research, 2019: 1872134. doi: 10.1155/2019/1872134.

[20] Qin J, Li Y, Cai Z, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes [J]. Nature, 2012, 490(7418): 55-60.

[21] Ouyang J, Lin J, Isnard S, et al. The bacterium: a sentinel for gut permeability and its relevance to HIV-related inflammation [J]. Frontiers in Immunology, 2020, 11: 645. doi: 10.3389/fimmu.2020.00645.

[22] Salguero M V, Alobaide M A I, Singh R, et al. Dysbiosis of gram-negative gut microbiota and the associated serum lipopolysaccharide exacerbates inflammation in type 2 diabetic patients with chronic kidney disease [J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2019, 18(5): 3461-3469.

[23] Derrien M, Vaughan E E, Plugge C M, et al.gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54(5): 1469-1476.

[24] Derrien M, Belzer C, De Vos W M.and its role in regulating host functions [J]. Microbial Pathogenesis, 2017, 106: 171-181.

[25] Tirosh A, Calay E S, Tuncman G, et al. The short-chain fatty acid propionate increases glucagon and FABP4 production, impairing insulin action in mice and humans [J]. Science Translational Medicine, 2019, 11(489): eaav0120. doi: 10.1126/scitranslmed.aav0120.

[26] Shams S, Foley K A, Kavaliers M, et al. Systemic treatment with the enteric bacterial metabolic product propionic acid results in reduction of social behavior in juvenile rats: contribution to a rodent model of autism spectrum disorder [J]. Developmental Psychobiology, 2019, 61(5): 688-699.

[27] Murri M, Leiva I, Miguel Gomez-Zumaquero J, et al. Gut microbiota in children with type 1 diabetes differs from that in healthy children: a case-control study [J]. BMC Medicine, 2013, 11: 46. doi: 10.1186/1741-7015-11-46.

[28] Zhang H, Dibaise J K, Zuccolo A, et al. Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(7): 2365-2370.

[29] Groer M W, Luciano A A, Dishaw L J, et al. Development of the preterm infant gut microbiome: a research priority [J]. Microbiome, 2014, 2(1): 38. doi: 10.1186/2049-2618-2-38.

[30] Castaner O, Goday A, Park Y M, et al. The gut microbiome profile in obesity: a systematic review [J]. International Journal of Endocrinology, 2018, 2018: 4095789. doi: 10.1155/2018/4095789.

[31] Louis P, Flint H J. Diversity, metabolism and microbial ecology of butyrate-producing bacteria from the human large intestine [J]. Fems Microbiology Letters, 2009, 294(1): 1-8.

[32] Asarat M, Apostolopoulos V, Vasiljevic T, et al. Short-chain fatty acids regulate cytokines and Th17/Treg cells in human peripheral blood mononuclear cells[J]. Immunological Investigations, 2016, 45(3): 205-222.

[33] Van Herreweghen F, Van Den Abbeele P, De Mulder T, et al.colonisation of the distal colon byis largely mucin and pH dependent [J]. Beneficial Microbes, 2017, 8(1): 81-96.

[34] Ren D W, Li L, Schwabacher A W, et al. Mechanism of cholesterol reduction to coprostanol byATCC 51222 [J]. Steroids, 1996, 61(1): 33-40.

[35] Pfeiffer N, Desmarchelier C, Blaut M, et al.gen. nov., sp nov., a novel bacterium isolated from the intestine of an obese mouse [J]. Archives of Microbiology, 2012, 194(11): 901-907.

[36] Zhao C, Qu Q, Yang F, et al. Monascus ruber fermented Panax ginseng ameliorates lipid metabolism disorders and modulate gut microbiota in rats fed a high-fat diet [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2021, 278: 114300. doi: 10.1016/j.jep.2021.114300.

[37] Ruiz L, Margolles A, Sanchez B. Bile resistance mechanisms inand[J]. Frontiers in Microbiology, 2013, 4: 396. doi: 10.3389/fmicb.2013.00396.

[38] Wen K, Tao L, Tao Z, et al. Fecal and serum metabolomic signatures and microbial community profiling of postmenopausal osteoporosis mice model [J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2020, 10: 535310. doi: 3389/fcimb.2020.535310.

[39] Wegner K, Just S, Gau L, et al. Rapid analysis of bile acids in different biological matrices using LC-ESI-MS/MS for the investigation of bile acid transformation by mammalian gut bacteria [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2017, 409(5): 1231-1245.

[40] Jia W, Xie G X, Jia W P. Bile acid-microbiota crosstalk in gastrointestinal inflammation and carcinogenesis [J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2018, 15(2): 111-128.

[41] Thomas C, Pellicciari R, Pruzanski M, et al. Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases [J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7(8): 678-693.

[42] Han Y, Zhao M, Ouyang K H, et al. Sulfated modification, structures, antioxidant activities and mechanism ofpolysaccharides protecting dendritic cells against oxidant stress [J]. Industrial Crops and Products, 2021, 164: 113353. doi: 10.1016/j.indcrop.2021.113353.

[43] Chen J, Huang C L, Wang J J, et al. Dysbiosis of intestinal microbiota and decrease in paneth cell antimicrobial peptide level during acute necrotizing pancreatitis in rats [J]. Plos One, 2017, 12(4): e0176583. doi: 10.1371/journal.pone.0176583.

[44] Kang X, Zhao L B, Lu X G, et al. Characteristics of gastric microbiota in GK rats with spontaneous diabetes: a comparative study [J]. Diabetes Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy, 2020, 13: 1435-1447.

Effect of Fu Brick Tea on Improving Metabolic Disorders in Type 2 Diabetes Mice

DAI Xinyue1,2, GE Binggang1,2, ZHANG Xuwen1,2, LIU Wenwu1,4, DUAN Jichun5, FU Donghe1,2,3*

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 4 Tea Research Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 5. Hunan Dekang Tea Technology Co., Ltd, Changsha 410001, China

To investigate whether Fu brick tea (FBT) water extract can attenuate metabolic disorders in Type 2 Diabetes (T2DM)by regulating gut microbiota,a T2DM mouse model was established with streptozocin and 400?mg·kg-1FBT water extract administration. Diet, and water consumption, body weight, fasting glucose and glucose tolerance in mice were observed. Serum levels of insulinINS, total bile acid (TBA), total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), interleukin-1beta (IL-1) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-) were examined. Histopathological changes of ileum and pancreas were also observed. Furthermore, fecal samples were analyzed by 16?SrRNA gene sequencing. The results show that FBT reduced the serum lipid metabolism levels, blood glucose, and inflammatory cytokines. Simultaneously, FBT treatment significantly ameliorated pathological changes in the pancreas and ileum. Moreover, the diversity, structure and composition of T2DM-disrupted gut microbiota were restored by the supplementation of FBT. T2DM-induced increase in the relative abundance ofwas remarkably restored by FBT. FBT increased the growth of many key beneficial bacteria, including,,,,,,,and. Collectively, the study showed that FBT might alleviate dysbacteriosis and metabolic disorders in T2DM by increasing beneficial flora.

Fu brick tea, type 2 diabetes mellitus, gut microbiota

S571.1；R587.1

A

1000-369X(2022)01-063-13

2021-08-31

2021-09-17

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1604403）、國(guó)家自然科學(xué)基金（32002095、32172217）

代昕玥，女，碩士研究生，主要從事茶葉功能成分利用相關(guān)研究，974644744@qq.com。*通信作者：40086713@qq.com

（責(zé)任編輯：黃晨）