沉默環狀RNA_單酰甘油酯酶促進睪丸支持細胞增殖而抑制凋亡*

史圣甲 賈一凡 季興哲 周梁 張洲

(1.西北婦女兒童醫院生殖中心，陜西 西安 710003；2.腫瘤生物學國家重點實驗室·空軍軍醫大學免疫學教研室， 陜西 西安710032)

精子發生是一個復雜而協調的過程[1-2]，支持細胞是曲細精管中唯一的體細胞，為精子發生通過提供必需的結構、免疫和營養支持[3-4]。支持細胞數目及功能異常將導致精子發生障礙，在臨床上多表現為唯支持細胞綜合征(Sertoli cell-only syndrome，SCOS)[3,5]。因此，進一步探索支持細胞數目和功能的調控機制，將有助于深入理解精子發生機制，從而推動非梗阻性無精子癥的診療進展。環狀RNA(circular RNA， circRNA)是一類新近發現的內源性非編碼RNA[6-7]。大量研究證實circRNA可通過多種機制調控關鍵基因的表達，在多種疾病的發生及進展中發揮著至關重要的作用[8-9]。然而circRNA在精子發生及成熟中的功能尚不完全清楚。課題組前期文章發現非梗阻性無精子癥和梗阻性無精子癥患者睪丸組織中存在大量差異表達的circRNA，并通過實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)證實環狀_RNA0008045(Circbase ID：has_circ_0008045，circ_MGLL)在非梗阻性無精子癥睪丸組織中的表達較梗阻性無精子癥升高[10]，但具體功能仍待深入探索。因此，本研究進一步評估了circ_MGLL對支持細胞增殖及凋亡的影響，并探索了潛在機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 睪丸原代支持細胞(CP-H060RNA)及睪丸支持細胞專用完全培養基(CM-H060)購自武漢普諾賽公司。RNA提取試劑盒、細胞計數試劑盒-8(Cell count kit-8，CCK-8)、細胞凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。一步法RT-qPCR試劑盒購自北京康為世紀公司。Lipofectamine 2000購自Thermo Fisher公司，EdU細胞增殖試劑盒、si-circ_MGLL、si-正常對照(Normal control，NC)、miR-NC、miR-1228/miR-1233/miR-149/miR-924類似物(mimics)購自廣州銳博生物科技公司。

1.2 實驗儀器 NanoDrop紫外分光光度計購自Thermo Fisher公司，流式細胞儀購自Beckman公司，熒光定量PCR儀、多功能酶標儀購自BIORAD公司，熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉染 將50000個支持細胞鋪至6孔板，至細胞匯合度至60%時，取250 μL 無血清培養基+5 μL小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)/miRNA/質粒制備試劑I，取250 μL 無血清培養基+5 μL Lipofectamine 2000制備試劑Ⅱ。將試劑Ⅰ和試劑Ⅱ混合，孵育15 min，而后逐滴滴加至細胞，5 h后更換為完全培養基，48 h后進行后續功能學實驗。將轉染si-NC的支持細胞命名為si-NC組，轉染si-circ_MGLL的支持細胞命名為si-circ_MGLL組。

1.3.2 RNA提取和一步法RT-qPCR 胰酶消化si-NC組或si-circ_MGLL組細胞，1 mL裂解液充分裂解10 min， 1 mL注射器反復抽吸數次。加入200 μL氯仿，震蕩15 s，室溫放置5 min，4℃、13400 g離心后，吸取水相層。加入1/2體積的乙醇，轉移至吸附柱中，4℃、13400 g離心后加入500 μL去蛋白液。4℃、12000 g離心后加入500 μL漂洗液。4℃、13400 g再次離心去除殘留試劑，加入20 μL去RNA酶ddH2O，室溫放置2 min。4℃、13400 g離心，所得液體即為組織/細胞總RNA，NanoDrop測定RNA純度與濃度。配制一步法RT-qPCR反應試劑：12.5 μL 2×UltraSYBR Onestep Buffer, circ_MGLL/MGLL或相應對照正義及反義引物各0.5 μL，UltraSYBR Onestep EnzymeMix 0.5 μL，RNA模板1 μL(100 ng)，去RNA酶ddH2O補齊至25 μL。震蕩混勻后離心，上機檢測，PCR反應條件設定為反轉錄45℃ 10 min，預變性95℃ 5 min，變性95℃ 10 s+退火/延伸62℃ 45 s(35個循環)，4℃保存樣品至檢測結束。GAPDH正義引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAG TC-3′，反義引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTT CA-3′；circ_MGLL正義引物：5′-GCCTACCTGCTC ATGGAGTT-3′，反義引物：5′-AGACGGCATTCAG CAGTTG-3′；MGLL正義引物：5′-ACAACTTTCAA GGTCCT-3′，反義引物：5′-CGAGAGAGCACGCTG GAG-3′。GAPDH做為內參，相對表達水平計算公式：2-ΔΔct。

1.3.3 細胞計數試劑盒-8(CCK-8)檢測細胞增殖速度 將5000個 si-NC組和si-circ_MGLL組細胞鋪至96孔板，每組設置8個副孔，共5個96孔板。過夜培養后，兩組各取1板，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育1 h，酶標儀450 nm記錄吸光度值，此時數據為第0天數據。而后每天同一時間兩組各取1板細胞，重復上述步驟，獲取第1至第4天吸光度值。根據兩組吸光度值繪制細胞增殖曲線。

1.3.4 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)檢測增殖細胞 si-NC組和si-circ_MGLL組細胞加入100 μL EdU培養基孵育2 h。1×PBS清洗2次后加入50 μL甘氨酸，搖床孵育5 min。1×PBS清洗2次后加入100 μLApollo染色反應液，室溫避光搖床孵育30 min。1×PBS清洗2次后加入TrintonX-100搖床孵育10min。1×PBS清洗2次后加入Hoechst反應液，室溫避光搖床孵育30 min。1×PBS清洗2次后，熒光顯微鏡拍照。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞的凋亡和周期 收集si-NC組和si-circ_MGLL組細胞，1×PBS清洗3次，1 mL Binding buffer懸浮細胞，調整細胞密度至106/mL。檢測細胞凋亡：兩組細胞加入5 μL Annexin-V FITC，室溫避光孵育10 min，而后加入5 μL PI，室溫避光孵育5 min。1×PBS清洗2次，500 μLPBS重懸細胞，上機檢測細胞凋亡。檢測細胞周期：兩組細胞加入70%預冷乙醇500 μL固定，4℃過夜。離心后，400 μL PI染色液混勻，4℃避光孵育30 min。1×PBS清洗2次，500 μL PBS重懸細胞，上機檢測細胞周期。

1.3.6 熒光素酶報告基因檢測circ_MGLL和miRNAs結合關系 合成circ_MGLL全長序列，對熒光素酶報告載體psiCHECK2質粒進行XhoI和NotI酶切，將circ_MGLL插入psiCHECK2對應位點，所得載體即為Luci-circ_MGLL。當支持細胞密度至70%時，將Luci-circ_CLTLC1與miR-1228/miR-1233/miR-149/miR-924 mimics共轉染至支持細胞，根據共轉染成分的不同分為五組：Luci-circ_MGLL+miR-NC組、Luci-circ_MGLL+miR-1228組、Luci-circ_MGLL+miR-1233組、Luci-circ_MGLL+miR-149組、Luci-circ_MGLL+miR-924組。48 h后，裂解各組細胞，向細胞裂解液中加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑，混勻后測定相對熒光強度。而后加入100 μL海腎熒光素酶檢測試劑，混勻后多功能酶標儀測定相對熒光強度。根據兩次檢測熒光強度的比值計算各組相對熒光素強度。

2 結果

2.1 沉默circ_MGLL表達促進支持細胞增殖 RT-qPCR結果顯示，si-circ_MGLL可有效沉默支持細胞中呈環狀結構circ_MGLL的表達，而對呈線性結構MGLL的表達無影響(P<0.05)(見圖1A)。CCK-8結果顯示，沉默circ_MGLL表達后，支持細胞增殖速度加快(P<0.05 )(見圖1B)。EdU結果顯示，沉默circ_MGLL表達后，增殖細胞比例升高(P<0.05)(見圖1C、圖1D)，以上結果提示circ_MGLL抑制支持細胞增殖。

圖1 敲降circ_MGLL增強支持細胞增殖

2.2 沉默circ_MGLL表達抑制支持細胞凋亡 流式細胞術結果顯示，沉默circ_MGLL表達后，支持細胞凋亡百分比降低(P<0.05)(見圖2A、圖2B)，G1期細胞百分比明顯降低，S期細胞百分比明顯升高(P<0.05)(見圖2C、圖2D)，以上結果提示circ_MGLL促進支持細胞凋亡，阻滯細胞周期于G1期。

圖2 敲降circ_MGLL抑制支持細胞凋亡

2.3 circ_MGLL可結合相關miRNAs MiRanda、Targetsca和RNAhybird網站聯合預測circ_MGLL潛在結合的miRNAs (見圖3A)，結果顯示miR-1228、miR-1233、miR-149、miR-924和circ_MGLL具有較高的結合潛能(見圖3B)。序列比對分析提示circ_MGLL與miR-1228、miR-1233、miR-149、miR-924存在結合位點(見圖3C)。熒光素酶報告基因顯示：Luci-circ_MGLL與上述miRNA類似物共轉染后，相對熒光強度較miR-NC共轉染組明顯降低(P<0.05)(見圖3D)，以上結果提示circ_MGLL可吸附并結合上述miRNAs。

圖3 circ_MGLL潛在結合miRNAs

3 討論

支持細胞可為生殖細胞提供其分化及成熟必需的營養及免疫豁免微環境，其數目和功能異常將導致精子發生障礙[4,11-13]。既往研究已初步證實非編碼可通過多種機制影響睪丸支持細胞的數目和功能而調控精子發生[14-16]。如miR-4270通過靶向抑制生長停滯與DNA損傷誘導基因α(Growth arrest and DNA damage inducible alpha，GADD45A)的表達，而抑制人和小鼠支持細胞增殖并促進其凋亡，從而導致精子發生障礙[17]。另有研究[18]發現miR-202在非梗阻性無精子癥睪丸組織中表達升高，并抑制細胞增殖和生物合成功能。課題組前期研究也發現circ_0000116在非梗阻性無精子癥睪丸組織中表達上調，并可作為競爭性內源性RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)吸附miR-449a而抑制精子發生[19]。因此，進一步鑒定與支持細胞數目與功能相關的非編碼RNA，將有助于推動無精子癥診療進展。

課題組還發現非梗阻性無精子癥和梗阻性無精子癥患者睪丸組織中存在大量差異表達的circRNA，其中circ_0023313、circ_0008045(circ_MGLL)、circ_00058058在非梗阻性無精子癥睪丸組織中表達升高，而circ_0061817、circ_00002023、circ_00008533在非梗阻性無精子癥組織中表達下降[10]。其中尚無研究探討來源于單酰甘油酯酶(MGLL)第7外顯子的circ_RNA0008045(Circbase ID：has_circ_0008045，circ_MGLL)在睪丸組織中的表達及功能。因此選取circ_MGLL作為本研究的后續研究對象，結果顯示：沉默circ_MGLL的表達將導致支持細胞增殖能力增加、而凋亡水平降低。因此，推測異常升高的circ_MGLL將誘導支持細胞凋亡，而支持細胞數目異常將導致精子發生障礙，這可能是非梗阻性無精子癥的發病機制之一。

近年來，研究證實ceRNA機制是circRNA調控相關致病基因表達最常見的一種形式。circRNA可通過吸附并結合相關miRNAs，從而解除miRNAs對下游靶基因轉錄的抑制，進而參與調控相關疾病的發生及進展[20-21]。為了深入揭示circ_MGLL調控支持細胞增殖和凋亡的機制，本研究初步探索了circ_MGLL是否具有作為ceRNA的潛能。通過三個生物信息學網站[22-24]和熒光素酶報告基因實驗，我們發現circ_MGLL可結合miR-1228、miR-1233、miR-149、miR-924。既往研究顯示miR-1228在乙二醇甲醚暴露的動物睪丸中表達升高，并與細胞凋亡和分化密切相關[25]。此外，miR-1233可被證實可通過抑制雙特異性磷酸酶9(Dual-Specificity Phosphatase 9，DUSP9)的表達而抑制凋亡[26]。研究還發現，miR-149是精子功能的重要調控調控因子，其在人類胚胎早期發育過程中發揮重要功能[27]。因此，circ_MGLL可能通過結合上述miRNAs并抑制其相關功能，從而實現對睪丸支持細胞增殖和凋亡的調控。

本研究僅探索了circ_MGLL在睪丸支持細胞中的表達及功能，尚缺少大樣本的無精子癥患者睪丸組織標本的驗證性實驗。此外對circ_MGLL調控支持細胞增殖和凋亡機制的相關探索較為粗淺。盡管發現了一系列凋亡相關miRNAs是circ_MGLL的潛在結合因子，但仍需更深入的研究闡述相關miRNAs是否可介導circ_MGLL對支持細胞增殖和凋亡的調控。

4 結論

本研究結果發現，沉默circ_MGLL表達促進睪丸支持細胞增殖并抑制凋亡，并可吸附結合miR-1228/miR-1233/miR-149/miR-924。本研究初步探索了circ_MGLL對睪丸支持細胞增殖的調控機制，為非梗阻性無精子癥提供了潛在的診療靶點。