EPAS-1在透明細胞性腎細胞癌中的表達及意義*

陳海濱 王立姣 趙鵬 趙建軍 譚超

(河北工程大學附屬醫院 1.泌尿外二科;2.呼吸內二科;3.胸外科,河北 邯鄲 056004)

透明細胞性腎細胞癌臨床常見[1-2]，盡管治療手段取得了重要的進步，但其5年生存率仍然較低[3-4]?；虻漠惓１磉_是腎腫瘤發生和進展的重要分子遺傳因素[5-6]。近年學者發現內皮PAS結構域包含蛋白-1(EPAS-1)與腫瘤的形成有關。EPAS-1又稱低氧誘導因子2α(HIF-2α)，是1997年克隆出的含有HLH-PAS的蛋白，是缺氧的主要轉錄因子，在低氧時引起酶或基因變化發揮促進腫瘤進展的作用[7]。EPAS-1主要在低氧區域誘導癌基因表達、調節細胞異型增生促進血管新生，主要是為適應細胞微環境中的低氧狀態[8]。目前EPAS-1在透明細胞性腎細胞癌中的研究鮮少，其與細胞增殖的關系尚需要闡明。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月～2017年7月在我院確診為透明細胞性腎細胞癌并行手術治療的患者78例。其中男40例，女38例，年齡43～85歲，中位年齡60歲。腫瘤最大徑(0.6～9.5)cm，平均(4.3±1.1)cm；分級(Fuhrman)：Ⅰ級9例，Ⅱ級34例，Ⅲ級29例，IV級6例；其中30例伴有腎竇累犯，48例無腎竇累犯。均留取術后新鮮的腫瘤組織作為觀察組，留取距腫瘤標本肉眼可見的邊緣>3 cm的正常腎組織作為對照組，樣本均于-80℃冰箱中凍存。納入標準：①首次發病并手術治療，術后病理為透明細胞性腎細胞癌，并符合WHO中的標準及分型。②臨床及隨訪資料完整。排除標準：①診斷不明確或病理形態中伴有異源性上皮或間葉分化的腫瘤。②術前行放、化療。③伴有其它器官嚴重的內科系統疾病?；颊呋蚣覍俸灦ㄖ橥鈺?，研究符合《赫爾辛基宣言》中的相關要求，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗材料 選擇人腎透明細胞癌786-0細胞系和人腎皮質近曲小管上皮HK-2細胞系，購自中國科學院上海細胞庫。培養基PRMI1640及胎牛血清購自Gibco公司；ECL顯色液購自Thermo公司；EPAS-1、GAPDH、PCNA、二抗和DAB購自蘇州睿贏生物技術公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司；RIPA裂解液、胰酶消化液、質粒提取試劑盒、二抗及DAB購自武漢三鷹生物公司；載體和引物均由蘇州吉瑪基因生物公司合成，酶標儀為Thermo公司生產的MK3，PCR儀為美國Bio Rad IQ5。

1.3 方法

1.3.1 細胞的構建和培養 液氮中取出人腎透明細胞癌786-0細胞系和人腎皮質近曲小管上皮HK-2細胞系，冰上復蘇，應用10%胎牛血清RPMI 1640培養基，在37℃、5%的CO2濃度的孵育箱中進行培養。當細胞生長融合度至80%左右時，進行細胞傳代，調整細胞濃度為5×105個/mL接種于12孔板中，每孔1 mL。選擇人腎透明細胞癌786-0細胞系，設計小干擾RNA EPAS-1質粒并構建質脂體載體轉染建立小干擾RNA EPAS-1組(siRNA EPAS-1組)，并設立786-0細胞系的空白對照組(NC組)。

1.3.2 實時熒光定量PCR實驗 應用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測EPAS-1 mRNA的表達。Trizol提取總RNA后應用 Nanodrop2000微量紫外分光光度計測量提取的總RNA濃度和純度。引物序列：上游：TACGTGTGCCCGGTTACGTCGACCG，下游：TCGGGTTAAAGGCCAGATAGTAGAG。以RNU6B為內參基因，引物序列：上游：TCGTGATA GTGATGATCCAGCCA，下游：CGTAGTAGTAC AGATAGTAGATGA。逆轉錄合成cDNA，反應條件：16℃ 30 min；42℃ 30 min，85℃ 5 min后，4℃恒溫。實時熒光定量PCR反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1min，30個循環后進行延伸。讀取Ct值，以2-ΔΔCt法表示結果，以RQ進行定量分析。

1.3.3 免疫組化實驗 應用免疫組化SP法檢測組織中EPAS-1和PCNA蛋白的表達。切取4 μm切片，嚴格按實驗步驟加入一抗和二抗后行DAB顯色。操作由同一主管技師完成，做好質控工作，減少人為誤差。EPAS-1的顯色部位是細胞質和(或)細胞膜，以黃色-棕褐色為陽性。以二維評分法進行定量(著色強度和陽性率)。著色強度：無著色為0分，弱為1分，中為2分，強為3分。陽性率：選擇5個高倍(400倍)視野進行觀察，取平均值，陽性率<5%為0分，5%～10%為1分，以11%～25%為2分，以26%～50%為3分，以>50%為4分[9-10]。二者相乘為最終評分，總分范圍0～12分。以≤3分為陰性，以>3分為陽性。計算陽性率。PCNA的表達部位是細胞核，以黃色--棕褐色為陽性，選擇熱點區進行觀察，共選擇5個高倍(400倍)視野計算陽性率，取平均值，其陽性率即為增殖指數。

1.3.4 Western Blot實驗 應用Western Blot法檢測EPAS-1和PCNA的表達。以GAPDH為對照，基于新鮮組織，提取總蛋白，BAC法行蛋白濃度測定，SDS-PAGE凝膠配置后上樣、電泳、轉膜、封閉，嚴格按照說明書進行操作。利用Odessey紅外熒光成像儀掃描PVDF膜，以GAPDH為對照，分析灰度值，進行結果分析。

1.4 術后隨訪 患者均進行術后3年生存時間的隨訪，截止時間點為2020年7月31日。

2 結果

2.1 兩組中EPAS-1表達陽性率的比較 觀察組中EPAS-1的陽性率高于對照組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組中EPAS-1表達陽性率的比較[n(×10-2)]

圖1 EPAS-1的表達(IHC SP法)

2.2 EPAS-1在觀察組不同臨床病理特征中表達陽性率的比較 EPAS-1的陽性率在不同Fuhrman分級、腫瘤最大徑及PCNA增殖指數的表達中差異有統計學意義(P<0.05);而在有無腎竇累犯、不同性別及年齡分組的表達中差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 EPAS-1在觀察組不同臨床病理特征中表達陽性率的比較[n(×10-2)]

圖2 腫瘤中PCNA的表達(400×)

2.3 觀察組中EPAS-1的表達與生存時間的相關性 隨訪截止發現存活49例，死亡28例(其中1例因腦出血死亡，1例為意外死亡，均計為刪失值)，失訪1例。應用K-M生存分析顯示EPAS-1的表達與生存時間有關(2=4.0213，P=0.0210)。見圖3。

圖3 EPAS-1表達的生存分析

2.4 人腎透明細胞癌786-0細胞系和人腎皮質近曲小管上皮HK-2細胞系中EPAS-1蛋白和mRNA的表達比較 Western Blot結果顯示人腎透明細胞癌786-0細胞系中EPAS-1蛋白的表達明顯高于人腎皮質近曲小管上皮HK-2細胞系(P<0.05)；RT-PCR結果顯示人腎透明細胞癌786-0細胞系中EPAS-1 mRNA的表達明顯高于人腎皮質近曲小管上皮HK-2細胞系(P<0.05)。見表3、圖4、圖5。

表3 兩組細胞系中EPAS-1蛋白和mRNA表達的比較

圖4 EPAS-1蛋白的表達

2.5 人腎透明細胞癌786-0細胞系的siRNA EPAS-1組和NC組中PCNA蛋白和mRNA的表達比較 Western Blot結果顯示，siRNA EPAS-1組中PCNA蛋白的表達明顯低于NC組(P<0.05);RT-PCR結果顯示siRNA EPAS-1組中PCNA mRNA的表達明顯低于NC組(P<0.05)。見表4、圖6、圖7。

表4 siRNA EPAS-1組和NC組中PCNA蛋白和mRNA的表達比較

圖6 siRNA EPAS-1組和NC組中PCNA蛋白的表達

圖7 PCNA mRNA的表達

3 討論

透明細胞性腎細胞癌病變形成與基因和遺傳因素有關[11]。EPAS-1是從小鼠下丘腦細胞和HeLa細胞中克隆出的全長cDNA序列[12]，其開放閱讀框2607bp，編碼869個氨基酸，分子量為96.5kDa[13-14]。EPAS-1的基因定位于染色體的2p16-21，共有15個外顯子、14個內含子[15]，5′-端與AHR基因的內含子具有高度保守性，3′-端只有1個內含子[16]。EPAS-1與家族的同一成員HIF-1α具有相似的生化和轉錄活性。研究顯示在缺氧條件下，兩種蛋白質均能快速增多，而氧恢復后均快速下降[17]。同時抗氧化劑(NMPG)、蛋白酶體抑制劑等的處理也能引起細胞內兩種蛋白的增加，而H2O2能引起兩者表達的下降[18-19]。EPAS-1與HIF-1α的不同點表現為兩種蛋白質含量不一樣，一般來說，腫瘤細胞內EPAS-1含量較高，而HIF-1α主要表達在間質細胞和組織細胞內。EPAS-1和HIF-1α調控下游因子可能不同，EPAS-1主要是調控PCNA介導的細胞增殖，表現為腫瘤細胞增殖的特性，而HIF-1α主要是調控VEGF介導的血管生成，表現為間質的支持作用。EPAS-1對腫瘤相關巨噬細胞介導的作用不如HIF-1α的作用強[20]。

本研究結果顯示,透明細胞性腎細胞癌中EPAS-1的表達明顯高于正常腎組織，人腎透明細胞癌786-0細胞系中EPAS-1蛋白和mRNA的表達明顯高于人腎皮質近曲小管上皮HK-2細胞系，提示EPAS-1高表達是腫瘤形成的重要促進因素，即EPAS-1具有癌基因樣的作用。且EPAS-1表達的陽性率在不同腫瘤最大徑及PCNA增殖指數的表達中差異有統計學意義，siRNA EPAS-1組中PCNA蛋白和mRNA的表達明顯低于人腎透明細胞癌786-0細胞系，提示EPAS-1高表達是腫瘤細胞增殖的重要促進因子，抑制EPAS-1的表達能減弱腫瘤細胞的增殖，提示EPAS-1參與腫瘤細胞的分裂增生及腫瘤生長。結果顯示EPAS-1的表達與腫瘤的Fuhrman分級相關，由于Fuhrman分級與腫瘤進展及預后相關，因此EPAS-1表達升高是腫瘤進展及不良預后的重要指標，實驗觀察到EPAS-1的表達與生存時間有關，也進一步明確了EPAS-1與預后的關系。但是EPAS-1對預后的具體判斷價值尚需要進行多中心、多因素及大樣本分析后進一步明確。EPAS-1的異常表達對mRNA轉錄、翻譯均有重要的調節作用，并能調控核質的運輸，引起細胞增殖及腫瘤細胞的轉化[21]。EPAS-1在發揮功能時也常受很多因素的影響，如應激反應、細胞微環境的改變等。也有研究認為EPAS-1是誘導癌基因形成的因子之一，對細胞的浸潤性生長有重要促進作用[22]。EPAS-1能與AHR相互作用，與缺氧反應元件(5′-TACGTGCG-3′)結合，上調缺氧因子的表達。蛋白酶體的抑制劑能引起細胞內EPAS-1的活性改變，可以消除細胞內活性氧改變，使EPAS-1的表達升高[23-24]。EPAS-1也具有腫瘤血管生成的促進作用，腫瘤進展過程中的缺氧環境能使EPAS-1的轉錄活性增強，促進腫瘤的侵襲和轉移[25]。EPAS-1可提高其下游糖酵解酶基因的表達，影響腫瘤的失控性增殖和能量代謝[26]。

4 結論

EPAS-1在腎透明細胞癌中表達升高，在不同臨床病理特征中的表達有差別。EPAS-1可能對腫瘤細胞增殖有一定促進作用。檢測EPAS-1的表達可能與腫瘤的預后有關。