NUSAP1在膀胱尿路上皮癌組織中表達與淋巴結轉移的關系

劉革新 劉盼 湯乘

(中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院 1.急診科;2.泌尿外科,湖南 株洲 412007)

膀胱癌是泌尿系統常見的疾病之一，其發病率呈逐年上升趨勢，全世界每年超過43萬人被診斷為膀胱癌，并有16.5萬患者死于膀胱癌[1]。在中國膀胱癌的發病率為7.68/10萬，已居泌尿系腫瘤中首位[2]。膀胱癌轉移的主要途徑是通過淋巴結，首先轉移至盆腔淋巴結。并且膀胱尿路上皮癌(Bladder urothelial carcinoma,BUC)患者發生淋巴結轉移往往提示預后不良，而淋巴結轉移是一個極為復雜的過程，具體機制尚不清楚，影響因素也很多，包括腫瘤分期、病理分級等臨床病理特征[3]。目前，淋巴結轉移的診斷主要基于MRI掃描或CT掃描。核仁紡錘體相關蛋白1(Nucleolar and Spindle Associated Protein 1， NUSAP1)是最近研究發現的一種微管結合蛋白，在細胞有絲分裂過程中發揮著重要的調控作用，保證細胞周期的正常進行[4]。大量研究表明NUSAP1在腫瘤的發生、發展過程中起著重要的作用[5-6]。且研究表明NUSAP1在多種腫瘤中出現高表達，并促進腫瘤的發生發展與轉移[7-8]。盡管NUSAP1表達與致癌機制被大量研究，目前研究證實NUSAP1與膀胱癌生存預后顯著相關[9]，但是NUSAP1在膀胱癌中與淋巴結轉移相關性尚未闡明。本研究探討NUSAP1在BUC組織中的表達情況及其與臨床病理參數及淋巴結轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院2017年1月1日～2020年8月31日行膀胱癌根治性切除術后病理標本103例為觀察組，均經病理證實為BUC，患者術前均未接受化療、放療。另外從103例標本中隨機選取50例癌旁正常膀胱組織標本為對照組。觀察組年齡45～73歲；男85例、女18例；T1～T2期44例、T3～T4期59例；低級別尿路上皮癌29例、高級別尿路上皮癌74例；淋巴結轉移38例。

1.2 免疫組化 石蠟切片，脫蠟，水化，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中95℃熱修復，PBS沖洗，加入3%H2O2孵育滅活內源性過氧化物酶；加入血清封閉，室溫孵育；加入兔抗NUSAP1抗體(英國abcam公司)(一抗，工作濃度1∶200)，室溫放置30 min，4℃冰箱中過夜孵育；加入DAKO ChemMate EnVision試劑(二抗)，37℃恒溫箱中孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，乙醇梯度脫水，樹膠封片，鏡檢。

1.3 結果判定 高倍鏡(400×)下隨機選取3個視野，計算染色強度及染色細胞總數。①根據染色程度評分：無染色為0分，弱為1分，中等為2分，強者為3分。②根據染色陽性細胞百分率進行評分： <5%為0分， 5%～25%為1分， 25%～50%為2分， 50%～75%為3分， >75%為4分。①+②為總積分，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)，最終陽性率=弱陽性+陽性+強陽性/總例數。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，定性資料采用獨立樣本卡方檢驗，采用多因素Logistic回歸分析淋巴結轉移影響因素，以P<0.05為差異統計學意義。

2 結果

2.1 NUSAP1在BUC和正常膀胱組織中表達差異 NUSAP1主要表達于陽性細胞胞質中，觀察組及對照組NUSAP1陽性表達率組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 NUSAP1在膀胱尿路上皮癌和正常膀胱組織組織中表達情況

圖1 觀察組和對照組NUSAP1表達 (A、C為100×;B、D為400×，SP法染色)

2.2 NUSAP1表達水平與BUC患者病理參數關系 對NUSAP1表達水平和BUC患者臨床病理參數進行分析，發現103例BUC患者中NUSAP1表達水平與腫瘤的直徑、腫瘤個數、腫瘤的病理分級、淋巴結轉移和腫瘤臨床分期相關(P<0.05)，NUSAP1表達水平與BUC患者年齡、性別無相關性(P>0.05)，見圖2、表2。

圖2 BUC組織中不同NUSAP1表達水平(400×)(SP法染色)

表2 NUSAP1表達與BUC患者臨床病理特征的關系

2.3 NUSAP1表達水平及其他臨床病理參數對BUC患者盆腔淋巴結轉移影響 根據淋巴結有無轉移進行單因素分析，發現腫瘤的直徑、腫瘤個數、病理分級、臨床分期以及NUSAP1表達水平是BUC盆腔淋巴結轉移的影響因素，BUC患者年齡、性別與淋巴結轉移無明顯關系(P<0.05)。Logistic多因素回歸分析顯示，僅NUSAP1表達水平是BUC淋巴結轉移的獨立影響因子[OR=1.951，95%CI1.094～3.477，P=0.023]，見表3、表4。

表3 BUC淋巴結轉移影響因素分析

表4 Logistic回歸分析BUC淋巴結轉移影響因素

3 討論

膀胱癌是世界范圍內最常見的泌尿系惡性腫瘤，其中約30%為肌層浸潤性腫瘤[10-11]，其轉移的主要途徑是淋巴結轉移，并且淋巴結轉移影響BUC患者的生存時間和術后治療，是BUC患者預后的重要影響因素。且BUC患者淋巴結轉移發生率高，目前的研究表明，根治性膀胱癌切除+標準淋巴結清掃術后檢測統計淋巴結轉移陽性率高達13%～40%[12]。在臨床實踐中，有學者研究報道其中25%的患者術前評估淋巴結陰性，在行根治性切除術后被證實淋巴結轉移陽性[13]。淋巴結轉移作為膀胱癌復發的重要影響因子，術前是否存在淋巴結轉移嚴重影響其治療策略。因此，術前準確評估膀胱癌患者是否存在淋巴結轉移對其治療具有重要的意義。

NUSAP1是目前研究發現的一種新型微管結合蛋白，在細胞周期中發揮重要的調控作用，分子量為55kD，其表達水平在細胞周期G2/M期達到峰值，在細胞有絲分裂過程中通過參與紡錘體組裝和染色體分離，以調控細胞周期的正常進行[14]。研究表明NUSAP1表達下調使細胞形成異常的紡錘體，導致分裂形成異常的胞質，而NUSAP1的表達升高導致細胞核內微管聚集產生細胞周期停滯[15]。NUSAP1廣泛地參與到多種生理及病理過程。目前多項研究報道，在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中NUSAP1出現異常表達，且與腫瘤的發生發展及預后密切相關[16-19]。因此有研究學者推測NUSAP1可能參與腫瘤的形成，其中張猛[20]等在肝癌的研究中發現NUSAP1的出現顯著的高表達，并與肝癌的侵襲性及復發相關。同樣在乳腺癌中，NUSAP1也呈高表達，并且中腫瘤的侵襲轉移密切相關，并且下調NUSAP1可以抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時增強對表柔比星的敏感性[21]。本研究采用免疫組化檢測103例BUC組織中NUSAP1表達情況，發現NUSAP1陽性率85.4%，強陽性率(+++)為26.2%，陽性率(++)為42.7%，弱陽性率(+)為16.5%，證實了NUSAP1在BUC中存在異常高表達。同時分析NUSAP1表達與BUC組織病理參數的關系，結果顯示，BUC患者腫瘤直徑、腫瘤個數、病理分級、淋巴結轉移和臨床分期與NUSAP1表達水平顯著相關。

膀胱癌具有多發及易復發的生物學特征，最主要的轉移途徑是通過淋巴結，并且淋巴結轉移、病理分級及臨床分期是BUC患者預后的重要指標[21-22]。而目前在臨床實踐中，評估淋巴結轉移尚無有效判斷手段及客觀的分析，主要通過CT掃描或MRI掃描等資料。本研究通過多因素Logistic分析，結果顯示僅NUSAP1表達是淋巴結轉移的獨立影響因素，NUSAP1陽性患者的淋巴結轉移風險是NUSAP1陰性膀胱癌患者的1.951倍。NUSAP1有可能成為判斷淋巴結轉移的潛在指標。我們推測可能是NUSAP1高表達對BUC患者腫瘤個數、腫瘤直徑及病理分級產生影響，從而促進了淋巴結轉移。其中Gordon等[16,23]學者研究發現NUSAP1在前列腺癌中出現高表達，并且能增強前列腺癌細胞的增殖和侵襲能力，從而促進腫瘤向淋巴結轉移，研究表明NUSAP1可作為前列腺癌的腫瘤標記物。最近的研究也表明NUSAP1可作為在乳腺癌和非小細胞肺癌的獨立預后因素[5,18]。

研究NUSAP1表達與淋巴結轉移具有重要的臨床意義。目前對多次復發的非肌層浸潤性膀胱癌、高級別尿路上皮癌和原位癌，以及T2期以上的膀胱癌建議行根治性膀胱切除術加標準盆腔淋巴結清掃術。并且有學者認為根治性切除加擴大盆腔淋巴結清掃可顯著減少膀胱癌的復發[24]。但是，擴大盆腔淋巴結清掃術將導致手術時間增加，并發癥也相應增加。而目前對于評估BUC患者是否存在淋巴結轉移主要采用MRI或者CT掃描，容易產生漏診及誤診[25]。并且目前的研究中，尚無預測淋巴結轉移的可靠指標。

4 結論

本研究結果提示，NUSAP1可作為盆腔淋巴結轉移的獨立影響因子，可能成為預測BUC患者淋巴結轉移的有效指標，為患者行盆腔淋巴結清掃提供參考依據。但是本研究病例數有限，缺乏多中心支持，且為回顧性研究，對NUSAP1的具體作用機制仍需擴大樣本量、多中心更深一步的研究。