流動注射化學發(fā)光法測定水中鉻實驗教學改進研究*

王冬梅，葉長江，周 歡，孫恩濤

(皖南醫(yī)學院檢驗學院，安徽 蕪湖 241002)

重視實驗實踐教學，提高大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力和實際操作能力，是一流本科人才培養(yǎng)的重要方面[1]。實驗課不僅要保證開出率，還要保證與理論課相輔相成，讓學生通過實驗課更好的理解運用理論知識并提高動手能力和實驗技能。

化學發(fā)光法屬于分子發(fā)光光譜分析法的重要分支，具有靈敏度高、線性范圍寬、快速、易自動化、低成本等特點，在醫(yī)藥[2]、環(huán)境監(jiān)測[3]、食品檢驗[4-5]等方面都有著廣泛的應用。流動注射化學發(fā)光儀作為一種價格低，操作簡便，靈敏度高的檢測儀器，在各檢測單位及機構十分常見，因此很多院校的儀器分析課開設了“化學發(fā)光法測定水中鉻”這一實驗內容。化學發(fā)光法測鉻不僅靈敏度和選擇性好，精密度和準確度也很有保障，通過此實驗可讓學生充分理解并掌握流動注射進樣技術與化學發(fā)光定量分析相結合建立的一種有效痕量分析技術。但在實際教學過程中，發(fā)現傳統(tǒng)的講授后，學生對儀器的優(yōu)勢及構造認識不深，只是機械的“按方抓藥”，對儀器的構造及其背后的原理理解不深刻，并不能與學過的理論知識融會貫通，學習處于被動，浮于表面，自然談不上對實驗的興趣、熱情和主動性[6]。為了加深學生對流動注射-化學發(fā)光法優(yōu)勢及基本原理的理解，有必要在教學環(huán)節(jié)上作一系列的設計，在課程導入、構造講解、知識拓展等方面需要教學改進，通過結合實際案例，拆解關鍵組件，增加實驗課的深入性、趣味性，激發(fā)學生對儀器分析實驗的興趣，亦對其他類似實驗課在實驗教學改進方面具有借鑒意義。

1 原實驗方案

儀器分析實驗“化學發(fā)光法測定水中鉻”，作為化學發(fā)光法中的一個較為經典實例，在眾多高等教育實驗教材中均有出現。本文的實驗改進以2015年出版的王倫等人主編的高等學校教材—《化學實驗》(第二版)中冊的實驗四“流動注射化學發(fā)光法測定水中鉻”為基礎。

1.1 實驗內容

1.1.1 試液配制

分別吸取100 μg·mL-1的鉻(Ⅲ)操作液0.0、0.5 mL、 1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL及2.0 mL水樣于50 mL容量瓶中，分別加入5 mL 2.5 mol·L-1KBr溶液，5 mL 1.0×10-2mol·L-1KBr溶液，二次水定容。

1.1.2 測定

儀器(示意圖見圖1)通電后30 min，打開測試軟件，進行參數設置：調節(jié)高壓至500 V，增益至1，蠕動泵采樣速度為30 r/min，進樣速度為25 r/min，穩(wěn)定30 min。當將系統(tǒng)中的管路與相應的溶液接好后，在測量界面點擊開始測量，系統(tǒng)自動運轉并自動記錄光強-時間曲線。儀器停止后，在數據處理界面找出光強-時間曲線中的最大峰值。

圖1 流動注射化學發(fā)光分析儀示意圖

每個樣品平行測定三次，取平均值，繪制光強-濃度工作曲線，并計算出未知樣品的鉻的含量，最后用蒸餾水將儀器徹底清洗并關機。

1.2 不足之處

(1)原實驗方案中只關注了儀器的操作步驟，沒有對化學發(fā)光分析法的特點進行剖析?；瘜W發(fā)光本身的特點決定了化學發(fā)光必須與流動注射進樣器聯用才能具有較好實用價值。因此，對于流動注射進樣器的作用的分析應是本實驗較為重要的內容。而原方案中沒有相關內容介紹。

(2)對于儀器分析實驗來說，儀器構造和工作原理是除實驗基礎理論以外的另一重要內容。因此，本實驗中，流動注射-化學發(fā)光儀的儀器構造的詳細解析是非常重要且必要的。然而，原方案中的儀器構造部分內容(圖1)僅介紹了化學發(fā)光檢測器的結構，而對發(fā)揮重要作用的流動注射進樣器部件卻未做相應介紹，十分不利于學生整體理解掌握和熟悉操作流動注射-化學發(fā)光儀。

(3)精密度反映一組數據的離散程度，是評價定量方法的一項重要性能指標。在實際評價時，常以“誤差棒”的形式體現在所繪制的圖中。在常見的儀器分析實驗中，樣品進樣時的狀態(tài)通常等同于樣品信號采集時的狀態(tài)，單個樣品分析結果的離散程度普遍不高，難以清晰反映在圖中。而化學發(fā)光法由于進樣樣品僅為信號采集體系的眾多組成中的一部分，其單個樣品的檢測結果離散程度較大，非常適合于精密度(誤差棒)的教學實踐。而原方案中，僅計算了三次平均測試結果的平均值，未能充分利用該實驗特點開展定量分析法的性能評價教學。

2 改進研究

2.1 流動注射進樣器的導入

對于本實驗內容，流動注射進樣器的引入是一個重要內容。因此，進樣器作用的介紹及合理的內容導入是相對重要的。鑒于此，在介紹魯米諾在堿性條件下與過氧化氫產生的化學發(fā)光可以被部分過渡金屬離子(Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)等)催化而大幅增強以后，引入魯米諾試劑在刑事偵查上的應用介紹。利用“絲血尋兇”技術解析來闡釋魯米諾試劑參與的化學發(fā)光體系在定性分析領域的應用，同時提高學生對化學發(fā)光檢測技術的學習興趣。

在上述基礎上，告訴學生化學發(fā)光定性分析應用較早而定量分析應用較晚。引導學生分析化學發(fā)光用于定量分析可能存在的問題。通過討論得出，化學發(fā)光信號強度高度依賴于發(fā)光體系的混合狀態(tài)和信號采集時間點，傳統(tǒng)的手動進樣方式難以保證上述兩參數的重現性，因此用于定量分析時誤差大，實際應用受到限制。

在上述背景下，介紹流動注射進樣技術的定義、發(fā)展歷史和工作原理。明確流動注射進樣代替?zhèn)鹘y(tǒng)手動進樣能夠很好提高化學發(fā)光體系混合狀態(tài)和信號采集時間點的重現性，保證定量分析的準確性。如圖2，與流動注射聯用后，化學發(fā)光法就能夠廣泛用于定量分析領域，在環(huán)境檢測和衛(wèi)生檢驗方面發(fā)揮了重要作用。

圖2 流動注射-化學發(fā)光法測Cr(Ⅲ)示意圖

2.2 換向閥的拆解與展示

實驗所使用的儀器為流動注射-化學發(fā)光儀，主要由兩個相對獨立的部分組成：流動注射進樣器和化學發(fā)光檢測器。其中，化學發(fā)光檢測器的結構比較簡單，主要由光電倍增管和暗盒組成，在學習過熒光儀結構的基礎上，學生是比較容易理解的。而流動注射器部分主要由蠕動泵、混合器和換向閥組成，其中前兩個部件是比較容易直觀理解的。因此，對于本實驗來說，較好地理解換向閥的構造和工作原理是學生理解和使用整臺儀器的關鍵所在。

為了更好地理解換向閥的結構和工作原理，其拆解和展示十分必要。因此，實驗教學過程中，我們對流動注射進樣器的關鍵部件-換向閥進行了拆解講解，重點介紹限位點(圖3A和3B)的設置及液體通路設計，讓學生更好地理解左右閥位變換、閥位切換前后不同液體流動的走向。同時也捎帶介紹不同部件的材質，讓學生理解聚丙烯(硬塑料)和聚四氟乙烯(軟塑料)的有機結合在液體流路中的密封作用。

圖3 換向閥的拆解

化學發(fā)光檢測器的主要構成部分為光電倍增管，可以有效地將光信號轉換成電信號，從而被檢測。其光學檢測窗口及其配套的反應池附件的展示有助于學生更好地理解化學發(fā)光檢測器的構造。如圖4A所示，圓形玻璃記為光電倍增管檢測窗口，其材質為石英玻璃，其正上方放置反應容器。對于靜態(tài)注射-化學發(fā)光法，為了方便試劑添加，反應容器一般使用敞口玻璃皿。而在流動注射-化學發(fā)光法中，敞口玻璃皿不能自動排廢液，不利于儀器自動化測試的現實。此外，皿狀容器體積大，死角多，體混合狀態(tài)難以控制，發(fā)光信號波動大。因此，密閉管狀反應池不僅可以自動排液，還可以精準控制混合狀態(tài)、保證反應體系的實時更新(圖4B)。除此以外，反應池的螺旋狀設計可以大大提高發(fā)光液體在檢測窗口的停留時間，增大了信號強度，提高了儀器靈敏度。

圖4 流通反應池的拆解

2.3 總鉻含量測定內容的引入

盡管Cr(Ⅲ)是地表水中鉻元素存在的重要價態(tài)，但其工業(yè)廢水或受其污染的水體中鉻元素通常還以另一種毒性更大的Cr(Ⅵ)價態(tài)存在。一般認為，Cr(Ⅵ)的毒性是Cr(Ⅲ)的100倍，且更易被人體所吸收而在體內蓄積，因此環(huán)境中總鉻的檢測更加具有現實意義。目前總鉻測定的通用方法主要為原子吸收光譜法和分光光度法。其中原子吸收光譜法儀器較為昂貴，需要復雜的前處理過程。而分光光度法主要是將Cr(Ⅲ)轉換成Cr(Ⅵ)后，與二苯碳酰二肼顯色進行測定，靈敏度不高?；瘜W發(fā)光法由于靈敏度高、儀器簡單，能夠為中小型企業(yè)和基層環(huán)境檢測部門監(jiān)控環(huán)境水樣中總鉻含量提供較大便利。

為了更好地讓學生掌握化學發(fā)光法在環(huán)境檢測方面的應用，實驗教學中將Cr(Ⅲ)檢測拓展為總鉻的檢測具有較好的現實意義，能夠一定程度提升教學效果。因此，實驗教學中，我們使用亞硫酸氫鈉將工業(yè)廢水中Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)[7]，進行模擬樣品總鉻的檢測。此部分實驗內容經過試做，實驗現象明顯，教學效果良好。

2.4 數據處理軟件及相關的分析參數的熟悉

本實驗的教學對象是普通本科生中的高年級學生，引導學生使用常規(guī)數據處理軟件origin來對所得的實驗數據進行處理、繪圖對實驗類本科畢業(yè)設計的順利完成是非常有幫助的。使用化學發(fā)光進行定量檢測時，通常要以多次測量取平均值的方式來提高準確性?；瘜W發(fā)光教學實驗的特性為origin作線性關系圖中“誤差棒”的理解和繪制提供較為理想的情境。首先通過講解，讓學生理解平均值相同的一組測量數據可以差別很大，精密度能夠反映的是一組數據的一個離散程度，作圖時可以以“誤差棒”的形式體現出來。作圖時，先讓學生掌握標準差(Standard Deviation, SD)、標準誤(Standard Error, SE)、置信區(qū)間(Confidence Interval, CI)是常用的誤差棒的代表形式，熟悉相應的計算公式，通過計算掌握三者間的區(qū)別與聯系。在上述三種表現形式中，SD是誤差棒使用最多的代表形式，反映的是數據點圍繞均值的分布狀況。同時也應該指出，為了避免混淆，使用誤差棒時應該明確指出其代表的具體概念。

除了上述誤差棒的理解與掌握外，本實驗教學過程中，也可以讓學生進一步掌握使用origin軟件來處理所得數據，繪制化學發(fā)光信號隨Cr(Ⅲ)濃度增加的變化圖及線性關系圖。作為一種重要的科研數據處理軟件，在本科中的高年級階段逐漸強化origin使用是非常有必要的，能夠提高學生在大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目和畢業(yè)論文寫作中的數據處理和分析能力。

3 結 語

我們結合實際教學實踐，對流動注射-化學發(fā)光法測水中的鉻離子儀器分析實驗教學進行了改進。改進后的實驗能夠較好激發(fā)學生對化學發(fā)光分析法的學習興趣，加深對化學發(fā)光用于定性和定量分析的理解，使得學生能夠較好理解流動注射-化學發(fā)光儀器的構造、工作原理及優(yōu)勢。實施于教學之后，學生反饋良好，對儀器的理解更加深入透徹。