木霉-植物互作生物防治機理及效應蛋白研究進展

張佳琳，李曉龍，王麗君，趙培寶

（聊城大學農學與農業工程學院，山東聊城 252000）

由于人口的激增，人類面臨糧食短缺的困境，農業生產也面臨巨大的挑戰。如何避免過度使用化學農藥對環境造成的污染、應對不良環境條件及病原體對作物造成疾病成為亟待解決的問題。開發能夠自然提高植物活力的生物系統，抵御生物和非生物脅迫，從而促進它們的生長，是應對這些挑戰的一個可行策略。而長期過度依賴化學農藥的使用，已出現了嚴重的土壤、水分等生態環境問題。隨著綠色農業發展戰略提出及國際大環境推動，生物防治措施日益受到關注，選擇對環境友好、對人畜安全、并且兼具防治病蟲害的生物農藥至關重要。木霉菌作為一種重要的生防菌，屬于叢梗孢科的一種腐生型絲狀真菌，其主要存在于森林、草地等較為潮濕的生態環境中，廣泛分布于土壤、根際、葉圍等環境中[1]。木霉由于其適應環境能力強，可以在各種有機和無機營養源中定殖。木霉種類有200 余種，常見的木霉有綠色木霉菌、哈茨木霉菌、深綠木霉菌、里氏木霉菌和長枝木霉菌等。在病害防治方面，木霉對病原真菌和細菌的抑制作用主要通過競爭、誘導抗性、重寄生、抗生作用來實現。木霉的競爭作用是通過在適宜環境中迅速繁殖實現對植物根系形成保護，利用其自身強大的空間利用能力和營養吸收能力來破壞病原菌對植物的侵染。誘導抗性作用是木霉菌以病原菌相關分子模式（MAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs）激活免疫反應，實現木霉菌誘導植物抗性。重寄生作用是指病原菌被木霉菌識別、接觸、穿透后實現對病原菌菌絲的溶解。抗生作用是通過木霉菌與病原菌互作過程中產生的乙烯、氫氰酸等揮發性代謝產物及抗菌肽等非揮發性次生代謝產物來抑制病原菌生長，且通過改變次生代謝產物及其功能基因可提高木霉菌抗脅迫作用[2]。

隨著對木霉生防機制研究的深入，木霉的生防作用不僅存在于木霉與病原菌之間，同時也存在于木霉與植物之間。木霉與植物互作存在很多的過程，例如木霉與植物之間的互相識別、兩者之間的激素信號的傳遞、誘導植物系統抗性的激活等[3]。本文通過對木霉與植物互作生物防治機理及木霉與植物互作過程木霉產生的效應蛋白參與免疫防御反應方面進行綜述，以期明確木霉在與植物互作過程中的作用機理，提高木霉菌的生物防治效果及在農業生產方面的應用潛力。

1 木霉與植物互作生物防治機理

植物依靠自身各種重要的生理生化過程來適應不同生態環境條件。目前植物受到許多嚴酷的環境脅迫及各種寄生病原物的攻擊，如病毒、細菌或真菌，這往往導致植物生長遲緩或產生疾病。為了適應生存環境的改變，通過長期的共同進化，植物已產生許多策略來對付它們的敵人。為了防止病原微生物的入侵，利用了固有的兩層免疫系統，即基于PAMP/MAMPs 誘導初級防御觸發免疫（PTI）來感知對抗入侵微生物和第二道防御效應器觸發免疫（ETI）感知微生物的效應因子，從而快速增強寄主防御反應[4]。通過識別病原體衍生的信號分子MAMPs 或DAMPs，可以實現對外部病原體的早期識別，激活免疫反應。木霉菌通過產生分泌蛋白、次生代謝物、細胞壁降解酶等作為效應子，通過分別增強MAMPs/DAMPs 分子和效應子激發的兩種免疫反應、減弱效應子引起的感病反應這三種途徑實現木霉菌誘導植物抗性。寄主植物所產生的復雜的先天免疫系統在許多生態系統抵御破壞性病原體的反應機制中已經得到證實。為了抵制入侵者，植物進化出系統獲得性抗性（SAR）和誘導系統抗性（ISR），通過激活水楊酸和茉莉酸的產生來觸發植物的防御反應[5]。盡管SAR 和ISR 通過不同的生理激素途徑發揮不同的作用，但有研究表明這些不同類型激素之間存在重疊功能。通過介導致病相關基因非表達者信號傳導的免疫系統，激活分子機制復合體對遠端病原微生物的系統抗性。

有益微生物是指能夠刺激共生宿主植物的生長發育，促進水和營養物質的吸收，增強對病原體的免疫力。常見有益微生物包括植物促生長根瘤菌和植物促生長真菌，通常生活在根表面的根際或是寄生植物的內生菌。現有研究表明，木霉菌是一種常見的有益微生物，通過菌絲表面分泌疏水蛋白來識別植物根部表皮細胞，以附著胞形式實現菌絲附著，進而菌絲滲透到植物表皮內部，并分泌纖維素酶降解細胞壁，在定殖過程會受到水楊酸調控[6]。同時作為土壤中的一種促生菌，木霉菌可在根際生長繁殖后促進植物生長發育、提高產量。

2 木霉與植物互作過程產生的效應蛋白

2.1 半胱氨酸蛋白

半胱氨酸蛋白具有LysM 重復序列，是木霉中分泌蛋白最豐富的一種蛋白，對應于4 個及以上半胱氨酸殘基。幾丁質是真菌細胞壁的主要成分，在植物識別病原體激活宿主免疫反應起到重要的作用，幾丁質酶參與植物病原真菌細胞壁中幾丁質的催化分解，釋放具有生長素運輸抑制劑等有絲分裂和形態形成作用的寡糖[7]。LysM 效應子不僅可以保護真菌菌絲，干擾植物傳遞幾丁質酶的活性，還能通過阻止真菌細胞壁產生的幾丁質片段，避免免疫反應的發生。現有研究表明，黃分枝桿菌含有LysM 結構域的效應蛋白Ecp6，通過擾亂幾丁質觸發的宿主免疫來介導毒力，在感染植物過程中，Ecp6通過隔離入侵菌絲細胞壁釋放的幾丁質寡糖來防止宿主免疫。Romero 等人研究表明，深綠木霉產生LysM 蛋白Tal6，能夠與復合幾丁質結合，保護菌絲免受幾丁質酶的侵害，增加真菌寄生能力，并調節植物防御系統的激活[8]。

2.2 cerato platanins蛋白

cerato platanins蛋白是一種非催化分泌蛋白，能夠削弱細胞壁纖維素聚集體。CP蛋白家族通過保守的氨基酸殘基與幾丁質等低聚物結合，識別潛在病原體分子模式，誘導免疫防御反應。大部分的CP 蛋白都是在真菌細胞壁中分泌和定位的，這類蛋白在真菌和宿主植物的相互作用中發揮積極作用。綠色木霉、深綠木霉與植物互作分別產生小蛋白sm1/sm2/sm3 和誘導植物應答Epl1/Epl2/Epl3。Cheng 等研究發現，sm1/Epl1 可以作為微生物或微生物相關分子模式刺激植物免疫反應，sm1/Epl1 蛋白的單體在玉米中可以誘導植物防御反應，二聚體可以阻斷ISR 激活；與sm1/Epl1相比，Sm2/Epl2 蛋白在玉米根系定植中作用更加明顯[9]。Azzagli 等人研究表明，綠色木霉在植物根系定殖過程中，sm1 表達增強，在sm1 浸入玉米和棉花葉片，有助于防治炭疽病，激活植物免疫系統[10]。

2.3 疏水蛋白

疏水蛋白是一種分泌蛋白質，只存在于真菌中，由8 個保守的半胱氨酸殘基構成，其表面活性較高，具有高度疏水性。疏水蛋白位于菌絲和分生孢子細胞壁的外表面，參與了木霉菌菌絲與植物根系的附著，介導真菌與環境之間的相互作用，以及在真菌與寄生蟲相互作用中形成附著胞。在綠色木霉中發現關于編碼疏水蛋白的基因，在木霉與植物互作過程中發揮作用。Huang 等研究表明，施用純化的重組疏水蛋白于楊樹幼苗，可以激活茉莉酸和水楊酸信號轉導途徑，說明疏水蛋白參與促進楊樹植物的生長和防御[11]。Ruocco 等人研究發現，敲除長枝木霉中疏水蛋白HYTLO1，其拮抗活性和促進植物的生長能力下降，說明該蛋白可以激活防御反應促進植物生長發育[12]。

2.4 糖基水解酶

糖基水解酶是一類以內切或外切方式水解糖苷鍵的酶，參與生物體糖的合成與水解，存在于大部分的生物體中。研究證實在木霉與植物互作過程中能夠產生這類蛋白質，Saravanakumar 等人通過在玉米葉片上施用哈茨木霉Thph1 和Thph2 兩種酶后，導致游離胞漿鈣含量的提高及活性氧的產生[13]。通過構建Thph1和Thph2 哈茨木霉缺失突變體，使得玉米中茉莉酸和乙烯信號通路相關基因的表達受到抑制。在酵母雙雜交系統中，Thph1和Thph2分別與植物的自噬相關蛋白和發芽樣蛋白結合，這種分子相互識別作用為分析這些靶標的細胞定位和參與誘導系統抗性提供了可能。

2.5 金屬蛋白酶

這類蛋白通過保留一定量的金屬離子來保持酶的活性，常見的金屬蛋白酶有胰蛋白酶、中性蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶等。這類蛋白是關于致病真菌組織降解相關的蛋白水解酶，Tvmp1 基因是金屬蛋白酶家族的主要成員之一，Khang 等人研究表明在深綠色木霉兩種真菌與擬南芥接觸前期Tvmp1 基因表達上調，但在接觸和生長發育階段不進行表達，說明該基因可能在木霉與植物互作早期誘導植物抗性發揮作用[14]。同樣，Jia 等人在水稻稻瘟菌中發現Avr-Pita 蛋白與曲霉菌和青霉菌的金屬蛋白酶具有同源性，可以誘導水稻產生抗性，也證明在誘導植物抗性中發揮作用[15]。

2.6 具有CFEM結構域的蛋白質

作為木霉屬中分泌較豐富的一類蛋白質，常見于真菌細胞外膜上。這類蛋白常作為信號轉導器或宿主病原體相互作用中的粘附分子或細胞表面受體來發揮作用[16]。通過生物信息學分析發現，在綠色木霉和深綠木霉中含有一些CFEM 結構的蛋白，參與和植物互作的過程中，但并非所有CFEM 蛋白都能作為植物防御的調節因子。tacfem1 是CFEM 家族成員蛋白之一，Reithner等人研究表明，該基因在與番茄紅素AG-4和辣椒紅素的對抗試驗中可以誘導植物抗性[17]。稻瘟病菌中的Pth11 蛋白參與附著孢子的形成，在寄主定殖中發揮作用，這表明tacfem1可能在植物和真菌的寄主定殖中發揮作用。

2.7 絲氨酸蛋白酶

絲氨酸蛋白酶種類豐富，它的酶催化活性位點上包含絲氨酸，通過斷裂大分子蛋白質中的肽鍵使之成為小分子，參與真菌代謝和附著胞形成[18]。絲氨酸蛋白酶家族的tvsep1 在木霉與植物接觸時和接觸之前表達上調，tvsep3 僅在接觸時表達上調。由于絲氨酸蛋白酶能夠降解肽鍵中的水解活性，tvsep1 和tvsep3 可能參與保護木霉菌菌絲免受宿主催化酶的侵害。Pozo等研究發現，用過表達絲氨酸蛋白酶的綠色木霉感染棉花幼苗，棉花幼苗表現出較少的病癥，表明其可能在誘導植物抗性中發揮作用[19]。

2.8 硫氧還蛋白

硫氧還蛋白是植物與真菌互作過程中產生的效應物和抗氧化劑，是一種NADPH 依賴的二聚體硒酶，通過半胱氨酸-巰基-二硫化物交換促進其他蛋白質的還原[20]。其家族中有2 種重要的硫氧還蛋白：硫氧還蛋白1（Trx1）和硫氧還蛋白2（Trx2）。由于硫氧還蛋白能夠直接與凋亡信號調節激酶1-ask1 結合，從而抑制導致凋亡的應激信號激活。研究表明，深綠木霉與擬南芥互作過程中，Trx2 表達上調，說明這種蛋白可能參與共生關系的建立，誘導植物的抗性[21]。

3 小結

目前，木霉是應用最為廣泛的生物防治真菌之一，不僅可以直接抑制病原菌的生長，還可以通過誘導植物系統抗性來應對病蟲害的威脅。此外，木霉的使用大大減少了化學農藥對環境的危害。關于木霉與植物互作機理的研究是熱點，植物系統抗性的產生與木霉產生的許多物質有關，通過了解木霉與植物的互作過程可以更加清楚木霉的生物防治機理，提高木霉生物防治的效果。現關于木霉與植物互作相關效應蛋白的研究較少，對接種木霉后植物轉錄組、蛋白組的改變的報道也比較少，而且研究的植物也比較受限制，大部分是在木霉與擬南芥、水稻、番茄及玉米等植物上，對于園林觀賞植物的應用較少。隨著分子生物技術的發展，關于木霉與植物互作產生的效應子研究將不斷增多，對這一過程產生的分泌蛋白功能將進一步明確，這將有利于明確木霉與植物互作過程中信號傳遞，從而探明木霉與植物互作的機理，為木霉的高效開發利用提供理論依據。