黃芪根瘤象取食脅迫對黃芪3種防御酶活性的影響

張大為 惠娜娜 袁偉寧 余海濤 魏玉紅

摘要：為明確黃芪根瘤象取食脅迫對黃芪葉片主要防御酶活性的影響及對黃芪藥效物質的可能影響，以黃芪根瘤象及其寄主膜莢黃芪為試驗材料，測定了不同取食誘導時間的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性變化。結果表明，取食24、48、72 h后，葉片PAL和POD的活性均顯著增加;取食24 h后PPO活性達到峰值，然后有所下降。表明黃芪根瘤象的取食脅迫激活了黃芪的化學防御，對黃芪的誘導抗性及次生代謝物質產生一定的影響，現有的黃芪根瘤象防治策略有待于更加科學的評估。

關鍵詞：黃芪;黃芪根瘤象;取食脅迫;防御酶

中圖分類號：S567? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2022）01-0059-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.01.014

Effects of Sitona Simillimus Korotyaev Feeding Stress on the Activities of Three Defense Enzymes of Astragalus Membranaceus

ZHANG Dawei， HUI Nana， YUAN Weining， YU Haitao， WEI Yuhong

（Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to clarify the effects of Sitonasimillimus feeding stress on the activities of main defense enzymes in leaves and the possible effects on the active substances of Astragalus membranaceus， the activities of phenylalanine ammonia-lyase （PAL）， peroxidase（POD）， and polyphenol oxidase（PPO） were measured at different feeding induction timesin the laboratory， by using Sitonasimillimus and its host Astragalus membranaceus as experimental materials. Theresults showed that the activities of PAL and POD in leaves increased significantly after 24， 48， and 72 hours， and the activity of PPO increased to the peak after 24 hours of feeding and then decreased. This study shows that the feeding stress of Sitonasimillimus activates the chemical defense of Astragalus membranaceus and triggers a certain effect on the induced resistance and secondary metabolites of Astragalus membranaceus. The existing prevention and control strategies of Sitonasimillimus need to be evaluated more scientifically.

Key words：Astragalus membranaceus;Sitonasimillimus;Feeding stress;Defense enzymes

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科多年生草本植物，以根入藥，是藥用價值很高的中藥材[1 ]。黃芪是甘肅省大宗中藥材品種之一，主要在甘肅省高寒陰濕區大面積種植，所產黃芪產量高、品質好，因而經濟效益顯著[2 - 3 ]。黃芪根瘤象（Sitona simillimus Korotyaev）是近年來新發現的主要為害黃芪的專食性害蟲[4 - 6 ]，在甘肅省隴西縣、臨洮縣、岷縣等黃芪道地產區均有發生。黃芪根瘤象以成蟲取食地上葉片，大幅削弱地上部的營養物質及光合作用能力;幼蟲在地下取食根系，造成的傷口還會導致病原菌及線蟲的侵染[7 - 8 ]，嚴重影響黃芪的產量及商品價值。由于生產中缺乏有效的防治手段，藥農往往采用高毒農藥拌毒土的方式進行該蟲的治理，其中不乏國家命令禁止使用的農藥。

植物由于自身不能移動，在與植食性昆蟲漫長的協同進化進程中形成了一系列的防御措施，以保證植物自身的正常生長發育[9 ]，最直接的體現方式是產生有毒的次生代謝產物，以抵御昆蟲的進一步侵害。次生代謝不直接參與植物的生長發育，但在抵御不良環境特別是植食性昆蟲的取食脅迫中發揮重要的作用[10 ]。因此，植物體內強大的防御酶系是植物應對昆蟲取食的防御開關，它們調控次生代謝物質的迅速合成和轉運，通過有毒物質或消化酶抑制劑等方式抵御植食性昆蟲的進一步取食。其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）是植物響應昆蟲取食脅迫的3種關鍵酶，也是被研究較為廣泛的3種酶，但相關研究多集中在經濟植物應對刺吸式口器害的取食脅迫方面[11 - 14 ]，對藥用植物對害蟲取食脅迫響應等的研究較少。

與其他經濟作物不同，藥用植物的次生代謝物質往往是其發揮藥效的活性物質。黃芪根瘤象是為害黃芪的重要害蟲，其取食脅迫對黃芪次生代謝的影響及機制尚不清晰。我們通過研究黃芪根瘤象成蟲取食誘導后黃芪葉片內PAL、POD和PPO活性的動態變化，以探明黃芪應對黃芪根瘤象取食脅迫的防御反應，分析取食誘導對黃芪次生代謝物質的影響的可能效應，為黃芪根瘤象的綜合治理提供更為科學的理論依據。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試黃芪種苗為膜莢黃芪種苗，購自定西市渭源縣會川鎮，移栽至甘肅省農業科學院植物保護研究所日光溫室內，所有種苗均罩尼龍紗網以防昆蟲取食，管理措施一致，定苗后21 d，挑選長勢一致的植株用于試驗。

黃芪根瘤象采自定西市隴西縣首陽鎮黃芪地，帶回實驗室后放入人工氣候箱，用新鮮黃芪葉片飼養，飼養條件為溫度（25±1） ℃，濕度50%±10%，光周期12∶12（L∶D），用于后續試驗。

1.2? ?試驗方法

將黃芪苗用直徑10 cm的玻璃筒罩住，每株接入3頭黃芪根瘤象成蟲，分別在取食0、24、48、72 h后收獲植物材料，測定黃芪葉片內防御酶PAL、POD和PPO的活力變化，每處理均重復3次。

采用試劑盒法測定黃芪葉片的PAL、POD和PPO酶活，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照說明書進行測定。PAL活力以1 g鮮樣在反應體系中1 min使290 nm 吸光度變化0.1 OD290值為1個酶活力單位;在37 ℃條件下，1 mg鮮樣中蛋白1 min催化1 μg 底物的酶量為1個POD酶活力單位;PPO活力以1 g鮮樣組織在1 mL反應體系中1 min使在420 nm處吸光度值變化0.01為1個酶活力單位。

1.3? ?數據分析

防御酶活力數據分析利用SPSS 21 軟件和Excel 2019軟件進行。采用單因素ANOVA進行方差分析，LSD多重比較法比較不同處理間的差異顯著性。

2? ?結果與分析

2.1? ?黃芪根瘤象取食對黃芪葉片PAL活性的影響

通過對葉片PAL活性的測定結果（圖1）可以看出，隨著取食時間的增加PAL活性呈現出先增加后降低的趨勢。由于黃芪根瘤象的取食誘導，黃芪葉片中PAL的活性迅速增加，取食48 h后達到峰值52.62 U/g，取食24 h（50.74 U/g）和48 h的葉片內PAL活力值顯著高于未取食前的29.99 U/g（P < 0.05）。取食72 h時PAL活性（40.95 U/g）仍高于取食前，但差異不顯著（P < 0.05）。

2.2? ?黃芪根瘤象取食對黃芪葉片POD活性的影響

對葉片POD活性的測定結果（圖2）顯示，黃芪根瘤象取食誘導對黃芪葉片的POD活性具有顯著的影響。未取食前葉片POD活力為8.78 U/（g·min），取食24 h后為41.07 U/（g·min），48 h后為44.38 U/（g·min），72 h后為41.72 U/（g·min），均比未取食時增加了5倍以上。取食24、48、72 h后，葉片的POD活性均顯著高于未接蟲取食前，取食脅迫對葉片POD的活性的影響顯著 （P < 0.05）。

2.3? ?黃芪根瘤象取食對黃芪葉片PPO活性的影響

由圖3可以看出，黃芪應對黃芪根瘤象的取食脅迫，迅速提升體內PPO的活性，24 h達到峰值30.22 U/（g·min），其后PPO活性有所回落，取食48 h[16.44U/（g·min）]和取食72 h[19.11U/（g·min）]時的葉片PPO活性雖高于未接蟲取食處理，但三者之間差異不顯著（P < 0.05）。

3? ?結論與討論

次生代謝是植物抵御病蟲害等外界不良條件的重要生命活動[15 ]，控制次生代謝活動的酶是植物應對昆蟲取食脅迫的關鍵單元，也是藥用植物活性物質生物合成的關鍵環節。本研究顯示，黃芪根瘤象取食脅迫誘導了黃芪的化學防御，黃芪體內PAL、POD和PPO 3種重要的防御酶活性均相應的發生了變化。

PAL是植物初生代謝和次生代謝轉化的樞? ? 紐[16 ]，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，在調控植物體內黃酮類、類黃酮及木質素合成中發揮關鍵作用[17 ]，而黃酮類物質也是黃芪的藥效物質主要成分。此外，木質素的合成對于黃芪根系的生長及增加細胞壁厚度提升抗性也有促進作用。本研究發現，黃芪根瘤象取食脅迫24 、48 、72 h后的葉片PAL活性較未取食時葉片顯著提升，表明適當的取食脅迫可能更利于黃芪藥效物質的積累及品質形成。

POD是植物體內與活性氧代謝有關的酶，是維持植物體內自由基在正常水平的重要保護酶，還可參與木質素的合成，提升作物的抗性[18 ]。以往的研究發現，植物在應對病原菌及刺吸式害蟲取食脅迫后，會顯著提升體內POD的活性以增加對害蟲的抗性。本研究發現，被咀嚼式口器害蟲黃芪根瘤象取食脅迫后，黃芪葉片POD活性也大幅提升，表明黃芪在受到外來侵害時做出及時而積極的響應，且這種響應是持續的。

PPO廣泛存在于植物體內，是可將酚類物質氧化成毒性更強的醌類或其衍生物的抗營養酶? ? 類[19 ]，常見于植物應對廣食性害蟲采取的質量防御策略[20 ]。本研究中，被黃芪根瘤象取食脅迫后，黃芪葉片內PPO活性急速增加，24 h即達峰值，表明黃芪對昆蟲取食脅迫的快速響應。同時，PPO的增加意味著體內酚類物質合成增多，而黃芪的藥效物質毛蕊異黃酮和黃芪皂苷均屬于酚類物質，因此，黃芪根瘤象的取食脅迫也能相應的增加黃芪體內藥效物質的含量。

前期田間調查顯示，黃芪根瘤象為害的地塊其他害蟲發生量較少，可能與黃芪根瘤象取食誘導的植物抗性相關。而作為專食性害蟲，黃芪根瘤象在與寄主黃芪的長期協同進化過程中也形成了相應的對策適應植物的化學防御。本研究表明，黃芪根瘤象的取食脅迫全面激活了黃芪的化學防御，而且適度的取食脅迫有可能促進黃芪藥效物質的積累。本研究僅設置了3頭/株的接蟲密度，其他取食壓力對黃芪防御酶活的影響有待進一步研究。黃芪根瘤象取食脅迫對黃芪次生代謝物質含量的影響，有待于結合多組學技術進行定性定量分析，以期全面評估黃芪根瘤象與黃芪的互作關系，為黃芪根瘤象的科學治理提供可靠的理論依據。針對黃芪根瘤象應改變現有的害蟲治理策略，因地因時制定科學的害蟲管理對策，本研究也可為藥用植物的害蟲治理策略提供新的視角及思考。

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