益生菌在虹鱒養殖中的研究與應用

樊丹，李紹戊，盧彤巖，王荻

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306）

益生菌一詞由拉丁語“pro”（代表）和“bios”（生命）構成。糧食及農業組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）則將益生菌定義為一種對宿主具有一定積極作用的活微生物。Basoulis 等認為，益生菌是活的微生物（細菌、酵母），足量使用可對宿主產生積極作用[1-3]。目前，益生菌被定義為對宿主健康有有益影響的微生物或化合物，其中微生物包括酵母菌、細菌和藻類[4]。自20 世紀80 年代以來，益生菌在水產養殖中的應用越加廣泛。

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）營養豐富、風味獨特而廣受消費者喜愛,是一種適應性較廣的冷水性魚類。隨著養殖規模的擴大，機體免疫力下降等問題嚴重制約著我國虹鱒養殖產業的健康發展。盡管漁用藥物仍然是控制病害的主要手段，但片面追求時效與經濟利益以及養殖從業人員科學用藥意識淡薄，抗生素濫用現象嚴重，帶來藥物殘留、微生物耐藥性等食品衛生和環境安全問題。使用益生菌能提高虹鱒的生長性能，增強免疫功能，減少用藥劑量[5-9]。

益生菌在醫療、生物發酵、基因工程等方面的研究和應用廣泛，但在虹鱒養殖中尚缺乏系統性研究的綜述。本文簡要介紹了益生菌的分類、補充方式，綜述了益生菌在虹鱒養殖中的應用研究進展，歸納了其對虹鱒的益生效果及益生機理，可為發展綠色高效的虹鱒養殖產業提供參考。

1 益生菌分類

根據2013 年《中華人民共和國農業部第105號公告》，允許飼料使用的微生物添加劑如表1 所示。在虹鱒養殖及相關研究與應用中，常用的益生菌包括：乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌以及其他菌類。其中，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是厭氧或兼性厭氧的細菌，在自然界分布廣泛。從細菌分類學上可分為：乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和奇異菌屬（Atopobium）等[10]。乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，適宜生長溫度為37℃左右，最適pH5.5～6.5，在腸道發酵產生有機酸和酶等物質，對宿主的生理功能、免疫系統、營養狀態、毒性反應、應激反應等具有重要調節作用[11]，是健康動物腸道中的優勢菌群，可維持腸道微生態平衡和機體健康[12]。芽孢桿菌中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）較為常用，它是一種好氧型革蘭氏陽性菌，耐高溫、耐酸堿、耐防腐劑，在飼料制作中易存活、易加工、便于儲藏[13]。酵母菌是一類以芽殖為主的兼性厭氧型真菌，適宜生長溫度為25℃，富含蛋白質、B 族維生素、礦物質等多種營養物質和輔酶A、輔酶I 及輔酶Q 等酶類，能夠促進腸道其他益生菌的生長，提高水產動物的消化率，增強機體免疫力[14,15]。其他一些菌類也可增強魚體免疫機能，如沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）可顯著提高虹鱒的生長性能[16]。

表1 農業部第105 號公告公布飼料允許的微生物添加劑Tab.1 Microbial feed additives approved in Announcement No.105 of the Ministry of Agriculture

2 益生菌的補充方式

益生菌的補充需要探索最適補給方式、最適劑量，并保證益生菌在干燥的顆粒中存活[17]。種類、劑型、補給載體、劑量水平和投喂時間等因素均影響益生效果。益生菌的補充方式包括：口服、注射和益生菌組合使用，常見的方式為投喂或灌喂。在魚類養殖中，飼料通常作為有效載體，將益生菌或益生菌細胞成分添加到飼料中，投喂或潑灑至養殖水環境中提供食物或保護劑以防感染[18,19]。Salinas 等[20]將乳酸菌和枯草芽孢桿菌等熱滅活后投喂金頭鯛（Sparus aurata L.），能有效刺激魚體免疫系統；Scott等通過腹腔或者肌肉注射方式補充益生菌后，顯著提高了虹鱒抵抗嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）感染的能力[21]。除單一菌種外，多種益生菌的混合使用對許多物種和養殖水環境均具有積極作用[22,23]。

3 益生菌對虹鱒的益生效果

3.1 生長性能

益生菌具有顯著提高虹鱒生長性能的作用。在飼料中添加釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）飼喂虹鱒成魚90 d 后，其餌料系數（FCR）明顯降低，體質量顯著增加[24,25]。Merrifield 等給虹鱒飼喂添加了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和糞腸球菌（E.faecalis）的混合飼料，其FCR 顯著下降，特定生長率提高，表明復合益生菌可有效促進虹鱒生長[26]。保加利亞桿菌（L.elbrueckii subsp.bulgaricus）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）和檸檬酸桿菌（Citrobacter farmeri）均可顯著提高虹鱒幼魚的增重率、特定生長率和相對增重率，降低FCR[27]。

3.2 消化酶活性

提高虹鱒腸道消化酶活性有助于機體分解營養物質，提高飼料利用率，促進機體生長發育[9]。長期飼喂含有保加利亞桿菌的飼料能顯著提高虹鱒后腸淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性[27]。Reza 等[28]的研究結果與上述相似：當糞腸球菌的補充水平達到1.0×109cfu/g 時，虹鱒腸道的脂肪酶、胰蛋白酶活性顯著提高。然而，部分益生菌未影響腸道消化酶的活性，如Harbi 等[29]發現Kocuria SM1 和Rhodococcus SM2 對虹鱒的消化酶指標無影響。

3.3 腸道菌群結構

補充外源益生菌后，虹鱒腸道菌落總數增加，細菌物種豐富度增加，致病菌的粘附性降低，機體免疫力提高[7]。Mohammadian 等[27]研究結果表明，長期飼喂含有嗜酸乳桿菌的飼料后，虹鱒幼魚腸道的乳酸菌數量和菌落總數顯著增加。Sharifuzzaman 等[28]發現：糞腸球菌的補充水平為1.0×108cfu/g 時，虹鱒腸道益生菌數量和菌落總數顯著增加。Ramos等[30]發現商業益生菌添加劑（主要為芽孢桿菌、乳酸菌），能促使虹鱒腸道菌落總數顯著增加，微生物豐富度顯著增加。

3.4 免疫參數

3.4.1 血細胞參數

紅細胞增多可增強機體的攜氧能力，而白細胞增多通常表示機體免疫應答能力增強[16]。長期投喂含酵母的混合飼料后，虹鱒血液中的紅細胞數量無明顯變化，白細胞中的單核細胞數量顯著增加。在飼料中添加腸桿菌和乳酸菌等同樣可以提高虹鱒白細胞數量[27,31,32]。

3.4.2 血清參數

血清參數在一定程度上可以反映機體的健康狀況。血清中的膽固醇水平可以反映機體內分泌平衡狀態；溶菌酶活性、補體活性、血清蛋白活性、呼吸爆發活性等與免疫反應與生長性能密切相關[17]。Mohammadian[27]和Hoseinifar[33]等研究結果表明，添加酵母菌使虹鱒血清膽固醇水平顯著降低，血清溶菌酶活性顯著升高，呼吸爆發活性降低，補體活性ACH50顯著升高。在飼料中補充添加腸桿菌、乳酸菌、芽孢桿菌等常用益生菌后，虹鱒的血清蛋白、IgM 抗體、組織相容性復合物、免疫球蛋白等蛋白活性增高[7,9,34]。

3.4.3 基因表達

常見的如腫瘤壞死因子、白介素、胰島素因子等mRNA 表達水平的變化與機體免疫功能或生長性能有關[17]。以乳酸菌為食源益生菌，抑制了虹鱒脾臟中腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素（IL-1β）的mRNA 表達水平；以酵母菌為食源益生菌，脾臟中TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達水平上調[24]。長期補給植物乳桿菌、乳酸乳球菌（L.lactis）和腸系膜球菌（Leuconostic mesenteroides）等益生菌，可促進虹鱒頭腎中炎癥細胞因子基因（TNF-α 和IL-1β）上調表達，腸道中胰島素生長因子IGF-2、脂肪酸轉運蛋白（FATP）、γ-谷胱甘肽轉移酶（γ-GTP）、IL-1β、IL-8和IL-10 基因的mRNA 表達水平顯著上調[35-37]。

4 益生菌的益生機制

4.1 鐵的競爭

生物需要補充營養以維持生存、生長和繁殖等生命活動。在多種營養元素中，鐵元素在DNA 復制、氧氣運輸、抗氧化應激、酶活性和能量生成等具有重要作用，也是構成鐵載體的必需元素[38]。鐵載體是細菌或真菌產生的低分子量鐵螯合化合物。益生菌產生的鐵載體對鐵離子具有更高的親和力，能降低病原對鐵的利用性能和對能量的利用能力，增強魚體的免疫力與抗病性[39-41]。

4.2 抑菌性能

細菌產生細菌素或其他代謝物可抑制甚至殺死其他細菌，以獲得更廣的生存空間與更多的營養物質[42]。如枯草芽孢桿菌可以產生表面活性素、伊枯草菌素等物質抑制其他細菌的增殖[43]。黏膜免疫相關研究結果表明，致病菌進入水生動物腸道并附著定殖在腸道黏膜表面最終導致疾病[44]，但是益生菌可以抑制病原菌的增殖，阻斷其附著位點，降低致病菌與腸道黏膜的結合性能，減少病原菌對宿主的損害[44,45]。保加利亞桿菌能夠定殖在魚腸黏液中，誘導腸道pH 降低，達到抑制病原微生物增殖的效果[46,47]。

4.3 提高酶活性

益生菌能產生不同種類的細胞外酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等調節宿主的新陳代謝過程，而魚體自身能夠產生多種內源酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、植酸酶、堿性磷酸酶等重要的消化酶[48]。內源性和外源性淀粉酶在草食性和雜食性魚類中非常重要，能將復雜的多糖物質降解為簡單的單糖，促進腸道對糖類物質的吸收[49]。當內源酶的數量和活性不足時，補充益生菌產生的外源性消化酶對提高消化酶活性、營養物質利用率、生長性能和促進消化吸收等具有重要作用[50]。

4.4 免疫調節

魚類的免疫系統是機體保護其免受病原感染的有效手段。近年來黏膜免疫的研究備受關注，其中有關腸粘膜的相關報道表明，腸黏膜的上皮細胞、黏液、微生物或黏膜下層的免疫細胞能夠相互作用，維持腸道正常生理功能，提高腸道的消化吸收能力，增強免疫反應[51]。攝食益生菌可調節腸道微生物組成（通常增加有益微生物的數量），抑制致病菌的增殖。益生菌可誘導黏膜免疫反應激活適應性免疫系統和補體系統，使白細胞增多，細胞因子和趨化因子如TNF-α、白介素（IL-6、IL-10、IL-12）和IFN-C 表達上調，提高宿主抗病能力[52]。Brown等[53]和DeCoffe 等[54]的研究結果也支持該觀點。他們還發現魚類免疫系統的主要活性物質是溶菌酶，能夠促進免疫細胞的吞噬作用、呼吸爆發、以及超氧化物歧化酶和粘液的產生。

4.5 改善水質

益生菌不僅可以提高魚類的免疫功能，還可以改善水質。Padmavathi 等[55]認為，益生菌可用作水產養殖業可持續發展的生物防治劑或生物修復劑，添加至重金屬污染或藻類爆發的水環境中，可導致Pb、Cd、Hg、Ni 等重金屬污染物減少，藻類生長減緩，起到了抑制病原體，增加營養素濃度、溶解氧濃度和水生有益細菌種群的效果[56,57]。

4.6 提供營養成分

作為食物添加劑，益生菌在腸道內降解時可提供β-葡聚糖等營養成分，與腸壁細胞核膜受體結合，產生信號傳送至腸道細胞膜受體，促進轉錄蛋白的激活、免疫基因的表達、細胞因子的合成和分泌[5]。Gantner 等[58]發現，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和乳酸乳球菌使得小鼠（Mus musculus）的IL-1β 和TNF-α 基因表達上調。他們認為這或許與吞噬細胞中β-葡聚糖相關受體的存在有關。

4.7 益生菌與腦腸軸

哺乳動物的腸道和大腦存在腸-腦-腸的環路，具有調節小腸組織的局部生理活動、調控腸源性交感神經元活動，檢測腸道微生物（如益生菌）及營養物質含量變化的作用[59-63]。改變腸道菌群組成能激活腸投射神經元，產生神經遞質，調控宿主的行為[64]。Rosengren 等[65]利用重復壓力限制測試，高壓條件下的虹鱒腸道完整性降低，虹鱒端腦中鹽皮質激素受體和血清素（一種神經遞質）受體表達水平高；應激激素皮質醇是通過下丘腦-垂體-腎軸釋放的、血清素參與魚類的認知過程與行為反應。他們認為下丘腦-垂體-腎軸參與了腦-腸軸調控過程。根據Rosengren 等[65]研究可知虹鱒可能也存在相應的腦-腸軸調控機制，而對于虹鱒腸道益生菌與腦-腸軸的相互作用，今后應做進一步研究。

5 總結與展望

使用益生菌能夠提高虹鱒生產性能、改善養殖水環境、增強機體免疫力，達到減少用藥的目的。但是，虹鱒養殖中使用益生菌的研究報道較少，存在以下問題：1）性能穩定的益生菌種類不豐富，菌體抗逆性和安全性研究結果缺乏；2）益生菌的作用機理研究不夠深入；3）高質量的益生菌產品（如飼料）需求大于市場供給；4）復合益生菌搭配不科學，特異性不強。為此，在虹鱒養殖中益生菌的研究可聚焦以下方面：1）重視益生菌的變異、質粒轉移及耐藥性等安全問題；運用高通量測序等技術手段分析菌群多樣性，以充實益生菌資源庫，提供優良益生菌候選菌株；2）探索益生菌的最適投餌策略，包括投餌量、投餌方式、投餌載體等，達到科學飼養、環保經濟的目的；3）加大研究力度，深入揭示益生菌作用機理、益生菌與宿主的相互作用；4）規范益生菌的復合使用，使其符合科學、合理、綠色經濟的理念；5）重視益生菌及代謝產物的研究，利用基因工程、發酵工程等技術提高益生菌代謝產物得率。