益氣健脾消瘀泄濁方對慢性腎衰竭大鼠骨骼肌自噬的影響

程天陽 馬書云 楊丹 夏虹 張冰冰 魯科達

1.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 杭州 310053 2.浙江中醫藥大學附屬第一醫院3.浙江中醫藥大學 4.浙江中醫藥大學附屬第三醫院

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）發展成終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）的共通途徑，在此過程中28%～54%的透析患者會伴隨不同程度的代謝紊亂和營養不良[1]，被稱作蛋白質-能量營養不良（protein-energy wasting，PEW）。作為CKD的常見并發癥之一，PEW以體質量減低、血清白蛋白水平下降、肌肉萎縮（muscular atrophy，MA）等為主要表現，其中MA被認為是判斷PEW嚴重程度的最佳指標[2]。另有研究表明，MA可使透析患者4～6年死亡風險上升3倍[3]，因此改善CRF患者整體營養狀態、防止肌肉萎縮，對提高其生存率及生活質量具有重要意義。

CRF患者出現PEW的主要原因是蛋白質合成與分解的代謝失衡。近年來研究發現，自噬溶酶體系統（autophagy lysosome system，ALS）作為一種新的蛋白質降解途徑，在維持骨骼肌細胞穩態的過程中發揮了重要作用[4]。而CKD相關的臨床研究和動物實驗中均證實研究對象骨骼肌存在自噬活化現象[5-6]，這提示自噬極有可能參與了CRF患者MA的發生發展。

益氣健脾消瘀泄濁方是魯科達教授基于“脾主肌肉”理論提出的治療CRF營養不良的專方，以補氣藥為主、化瘀藥為輔、健脾藥固本、蟲類藥為使，有益氣健脾、消瘀泄濁之功。前期研究已證實，其基礎方消瘀泄濁飲對CKD氣虛夾瘀證具有較好療效[7-9]。

本研究以CRF-PEW大鼠為研究對象，觀察益氣健脾消瘀泄濁方對其骨骼肌自噬相關基因表達的影響，探討益氣健脾消瘀泄濁方改善CRF-PEW的作用和機制，為該方的臨床推廣提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（specified pathogen free，SPF）級健康雄性SD大鼠30只，6周齡，體質量160～180 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號碼：SCXK（滬）2018-0006]，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2018-0012]。實驗期間予SPF級低蛋白飼料（酪蛋白60 g·kg-1、淀粉539 g·kg-1、糊化淀粉130.5 g·kg-1、蔗糖100 g·kg-1、豆油70 g·kg-1、微晶纖維素50 g·kg-1、礦物鹽混合物35 g·kg-1、維生素混合物10 g·kg-1、L-胱氨酸3.0 g·kg-1、 氯化膽堿2.5 g·kg-1）飼養，飼料購于江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司（批號：XTLPR001），自由飲水，保持晝夜節律，室溫（22±1）℃。本研究已獲得浙江中醫藥大學實驗動物管理與倫理委員會批準（批準編號：IACUC-20180507-06）。

1.2 藥品和試劑 益氣健脾消瘀泄濁方由生黃芪30 g、車前草20 g、地龍12 g、制軍10 g、桃仁12 g、川牛膝12 g、黨參15 g、白術15 g、茯苓15 g組成，以上中藥由浙江省中醫院中藥房提供，以單蒸水600 mL煎煮1 h，重復2次，混勻后以旋轉蒸發器濃縮至1.47 g·mL-1，4℃冰箱保存待用。復方α-酮酸片購于北京費森尤斯卡比醫藥有限公司（規格：0.63 g/片，國藥準字：H20041442），以0.9%氯化鈉注射液8 mL溶解，配制成78.75 mg·mL-1的混懸液，4℃保存待用。SYBR Green實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：CW2601）；二喹啉甲酸 （bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于Solarbio Cat公司 （批號：pc0020）；兔抗p62多克隆抗體、兔抗微管相關蛋白輕鏈3A/3B （microtubule-associated protein light chain 3A/3B，LC3A/B）多克隆抗體、兔抗Beclin-1多克隆抗體、兔抗叉頭框轉錄因子O3a（forkhead-box transcription factor O3a，Foxo3a）多克隆抗體均購于CST公司（批號：39749、4108S、3495S、12829S）。

1.3 主要儀器 TE2000-S型熒光顯微鏡購于日本Nikon公司；SorvallTMST 8型低溫高速離心機和Qubit4型核酸蛋白定量儀均為美國ThermoFisher Scientific公司產品；Mastercycler?nexus型普通PCR擴增儀購于德國Eppendorf公司；CMaxPlus型酶標儀為美國Molecular Devices公司產品。

1.4 方法

1.4.1 分組給藥 大鼠予普通飼料適應性喂養1周后，隨機挑選5只作為假手術組，僅剝離腎包膜；余下25只大鼠行二步法5/6腎切除，建立CRF大鼠模型，第2次術后改為低蛋白飲食喂養，制作CRF-PEW大鼠模型。以造模后大鼠體質量較假手術組下降20%以上為造模成功的主要標志，并將造模成功大鼠隨機分為模型對照組8只、陽性對照組8只、中藥治療組9只，造模成功次日開始灌胃給藥。根據人-大鼠體表面積的轉換系數6.25進行換算，中藥治療組大鼠中藥用量為1 mL·100g-1，陽性對照組大鼠復方α-酮酸片混懸液用量為0.7875 g·kg-1（根據60 kg成人用量7.56 g·d-1進行換算），模型對照組大鼠使用等體積0.9%氯化鈉注射液，各組灌胃量均為1 mL·100g-1，1次/d，持續8周。

1.4.2 標本采集 治療前后采用代謝籠收集大鼠24 h尿液；給藥前頜下靜脈采血，給藥完成后心臟取血，血液靜置離心后取上層血清，轉移至1.5 mL離心管；心臟取血后，于冰上剝離雙側脛骨前肌和腓腸肌，置于凍存管。所有標本均-80℃凍存，用于后續檢測。

1.4.3 指標檢測

1.4.3.1 腎功能檢測 采用全自動生化分析儀檢測大鼠給藥前后血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清白蛋白（albumin，ALB）以及24 h尿蛋白（24 hours urine protein，24 h Upr）水平。

1.4.3.2 骨骼肌形態改變觀察 大鼠骨骼肌放入10%中性甲醛中固定24 h后，取材包埋，切片后60℃烘片1 h，二甲苯脫蠟后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，200倍光鏡下觀察各組骨骼肌形態差異。

1.4.3.3 Real-time qPCR檢測骨骼肌p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達 嚴格按照總RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA并進行逆轉錄及擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參基因。引物由杭州鷹旸生物科技有限公司合成，序列見表1。設定標準曲線，將已提取的總RNA逆轉錄為cDNA進行擴增，反應條件：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環，72℃終止延伸5 min。生成擴增曲線和熔解曲線，采用2－△△CT方法計算各基因的相對表達量。

1.4.3.4 免疫印跡檢測骨骼肌p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達 取大鼠骨骼肌提取蛋白，蛋白定量后按照試驗操作步驟進行電泳、轉膜、封閉后，加入一抗，4℃孵育過夜。加入對應二抗，室溫避光孵育1 h后熒光法掃描顯像，并進行蛋白條帶分析，以GAPDH為內參，計算蛋白相對表達量。

1.4.3.5 免疫組化檢測骨骼肌Foxo3a表達 嚴格按照實驗步驟對骨骼肌病理切片進行抗原修復、免疫雜交、復染、封膠，在200倍光鏡下隨機選取6個不重復視野觀察染色區域，并采用Image Pro Plus 6.0軟件測定陽性染色面積（Area）、累積光密度（integrated optical density，IOD）值，并計算平均光密度值（mean optical density，MOD）進行半定量分析。

1.5 統計學分析 采用SPSS 25.0統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間總體比較采用單因素方差分析，其中方差齊的資料采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法進行兩兩比較，方差不齊的資料采用Dunnett's T3法進行兩兩比較；非正態分布的資料組間比較采用非參數檢驗方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能比較 與假手術組比較，治療前與治療后造模各組Scr、BUN均顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，治療后陽性對照組、中藥治療組Scr有所下降（P＜0.05），BUN顯著下降（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組治療后Scr、BUN降低更明顯（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠腎功能比較Tab.2 Comparison of kidney function in each group （±s）

表2 各組大鼠腎功能比較Tab.2 Comparison of kidney function in each group （±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，☆P＜0.05。Note:Compared with sham operation group，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with positive drug control group，☆P＜0.05.

BUN（mmol·L-1）治療前 治療后 治療前 治療后假手術組 28.53±2.07 38.98±3.74 2.64±0.18 3.47±0.50模型對照組 58.76±10.34** 55.15±9.46** 8.86±0.50** 10.77±2.29**陽性對照組 59.66±9.37** 45.95±4.77**△ 8.97±0.37** 7.37±0.47**△△中藥治療組 60.56±11.22** 42.94±5.22**△☆ 8.88±0.48** 6.15±0.54**△△☆Scr（μmol·L-1）組別

2.2 各組大鼠ALB與24 h Upr水平比較 與假手術組比較，治療前造模各組ALB水平下降（P＜0.05），24 h Upr升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，治療后陽性對照組ALB水平升高、24 h Upr下降（P＜0.05），中藥治療組ALB、24 h Upr變化更顯著（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組治療后ALB水平升高更明顯（P＜0.05）、24 h Upr降低更明顯（P＜0.05）。 見表3。

表3 各組大鼠ALB與24 h Upr水平比較Tab.3 Comparison of ALB and 24 h Upr in each group （±s）

表3 各組大鼠ALB與24 h Upr水平比較Tab.3 Comparison of ALB and 24 h Upr in each group （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，☆P＜0.05。Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with positive drug control group，☆P＜0.05.

24 h Upr（mg·24 h）治療前 治療后 治療前 治療后假手術組 32.06±0.68 32.82±2.04 22.56±1.77 23.96±2.55模型對照組 25.38±3.63* 24.50±2.06* 35.72±2.13** 36.10±3.07**陽性對照組 25.67±3.58* 27.51±1.18*△ 35.08±2.39** 30.05±1.44**△中藥治療組 25.80±3.59* 28.22±0.70*△△☆ 35.16±2.07** 27.51±0.75**△△☆ALB（g·L-1）組別

2.3 各組大鼠骨骼肌形態改變比較 與假手術組比較，模型對照組大鼠骨骼肌明顯萎縮；與模型對照組比較，陽性治療組與中藥治療組大鼠骨骼肌萎縮程度均有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌形態改變（HE染色，200×）Fig.1 Changes in skeletal muscle morphology of rats in each group（HE staining，200×）

2.4 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a表達比較

2.4.1 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達比較 與假手術組比較，模型對照組p62基因表達量降低（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1和Foxo3a基因表達量升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，治療后陽性對照組、中藥治療組p62基因表達量升高（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1和Foxo3a基因表達量均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組p62基因表達量升高更明顯（P＜0.05）、Foxo3a基因表達量降低更明顯（P＜0.05）。 見表4。

表4 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達比較Tab.4 Comparison of p62，LC3A/B，Beclin-1 and Foxo3a gene expressionin skeletal muscle in each group （±s）

表4 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達比較Tab.4 Comparison of p62，LC3A/B，Beclin-1 and Foxo3a gene expressionin skeletal muscle in each group （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，☆P＜0.05。Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with positive drug control group，☆P＜0.05.

組別 p62 LC3A/B Beclin-1 Foxo3a假手術組 0.99±0.07 0.99±0.03 1.01±0.11 1.02±0.10模型對照組 0.33±0.02** 1.09±0.02** 3.95±0.09** 3.57±0.49**陽性對照組 0.89±0.08*△△ 0.75±0.13*△ 2.50±0.33*△△ 1.57±0.26*△△中藥治療組 1.00±0.06*△△☆ 0.61±0.06*△ 2.23±0.12*△△ 1.22±0.05*△△☆

2.4.2 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達比較 與假手術組比較，模型對照組p62蛋白表達降低（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，陽性對照組、中藥治療組p62蛋白表達升高（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達降低（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組p62蛋白表達升高更明顯（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 免疫印跡檢測骨骼肌目標基因蛋白表達情況Fig.2 Expression of target gene protein in skeletal muscle by Western blot

2.4.3 各組大鼠骨骼肌組織Foxo3a表達比較 與假手術組比較，模型對照組、陽性對照組、中藥治療組骨骼肌細胞胞質中均顯示不同程度的棕褐染色，提示Foxo3a表達上調。見圖3。與假手術組比較，模型對照組與陽性對照組Foxo3a表達均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型對照組比較，中藥治療組與陽性對照組Foxo3a表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。 見表5。

圖3 各組大鼠骨骼肌中Foxo3a蛋白的表達情況（200×）Fig.3 Expression of Foxo3a protein in skeletal muscle in each group（200×）

表5 各組大鼠骨骼肌中Foxo3a蛋白表達比較Tab.5 Comparison of Foxo3a protein expression in skeletal muscle in each group （±s）

表5 各組大鼠骨骼肌中Foxo3a蛋白表達比較Tab.5 Comparison of Foxo3a protein expression in skeletal muscle in each group （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01.

組別 Area IOD MOD假手術組 106 293.858±9 930.774 4 223.246±440.466 0.040±0.007模型對照組 2 903 643.125±245 918.724** 164 787.390±10 908.831** 0.057±0.006**陽性對照組 2 618 414.623±208 672.230*△ 130 005.233±15 777.401*△ 0.050±0.007*△中藥治療組 620 986.378±34 813.336△△ 27 275.249±2 028.691△△ 0.044±0.005△△

3 討論

PEW是CRF患者的常見并發癥，在加速疾病進展的同時更易誘發心血管事件，增加感染風險，是ESRD患者住院率和死亡率增加的主要原因[10]。蛋白質合成與分解失衡是發生PEW的根本原因，包括膳食中蛋白質和能量攝入不足，以及由于代謝性酸中毒、內分泌紊亂以及微炎癥狀態等造成的蛋白質代謝失調，透析患者在治療過程中更容易伴隨額外的營養丟失。現有的臨床營養支持療法對經濟條件要求較高，患者依從性較差，且尚無足夠循證醫學證據支持其降低了患者死亡率。

祖國醫學認為CRF屬于“水腫”“關格”范疇，以脾腎虧虛為本，濁毒壅滯為標，病程日久，臟腑衰退，氣血兩虛，故面色無華，肢體痿廢。針對PEW導致的骨骼肌萎縮，魯科達教授依據“脾主肌肉”理論，強調健脾在CKD治療中的作用，其一“諸濕腫滿，皆屬于脾”，脾為太陰濕土，虛則水寒相侮，陽虛運化不利，飲停發為浮腫；其二“氣血生化，脾為之源”，脾為后天之本，受納運化水谷，消化吸收不佳，臟腑氣血失養；其三“脾氣散精，充養四肢”，脾為升降樞紐，協調五臟陰陽，水精四布不暢，肌骨筋脈失榮。由此，魯科達教授在“祛瘀生新”治法基礎上結合“脾主肌肉”理論，創立益氣健脾消瘀泄濁方，作為治療CRF-PEW患者的專方。該方為消瘀泄濁飲與四君子湯合方化裁所得，由生黃芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龍12 g、制軍10 g、車前草20 g、黨參15 g、茯苓15 g、白術15 g組成。方中重用黃芪補氣行血，鼓動諸藥；制軍蕩滌腸胃，消積破滯；桃仁、牛膝協同活血，逐瘀通經；地龍性喜走竄，功擅通絡；車前草利水通淋，導濁下行；參術茯苓助陽補氣，化濕健脾。氣足則推動，血行則瘀去，水行則濁泄，諸藥合用，消補兼施，共奏益氣健脾、消瘀泄濁之功。

自噬在PEW骨骼肌萎縮過程中發揮重要作用，其調控機制較為復雜，自噬相關基因（autophagy related genes，Atg）表達可受多種信號分子影響。p62是自噬特異性底物，可通過與Atg8的同源蛋白LC3結合，介導自噬-溶酶體系統降解[11]；Atg6同源蛋白Beclin-1，在自噬體的形成中必不可少，可促進自噬小泡的成核及胞質蛋白的招募，是自噬體形成的標志[12]；Foxo轉錄因子在CKD誘導的MA過程中起著關鍵作用，活性Foxo3a可通過自噬刺激肌肉中的溶酶體蛋白水解[6]。

本研究中陽性對照組使用復方α-酮酸片預防和治療因CRF導致的PEW，結果發現益氣健脾消瘀泄濁方的療效優于復方α-酮酸片。首先，益氣健脾消瘀泄濁方與復方α-酮酸片均可降低CRF-PEW大鼠Scr、BUN和24 h Upr水平，升高ALB水平；而益氣健脾消瘀泄濁方的調節作用相較復方α-酮酸片更為顯著，證實了該方對CRF腎功能的保護作用。其次，與假手術組比較，模型對照組大鼠骨骼肌明顯萎縮，p62基因及蛋白表達水平顯著下降，LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因及蛋白表達水平顯著升高，提示肌肉蛋白質分解可能與自噬激活有關；而中藥治療組大鼠骨骼肌p62基因及蛋白表達水平有所上升，而LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因及蛋白表達水平有所下降，比陽性對照組更顯著，表明益氣健脾消瘀泄濁方可抑制骨骼肌自噬從而改善MA，在該方面的作用亦優于復方α-酮酸片。

綜上所述，益氣健脾消瘀泄濁方對腎功能具有保護作用，且能夠在一定程度上改善CRF-PEW，減輕骨骼肌萎縮，其作用機制可能與抑制骨骼肌自噬有關。未來的研究將進一步探索益氣健脾消瘀泄濁方調控的具體信號通路，以加深對其作用機制的了解，為中醫藥多靶點治療與現代化推廣提供實驗依據。