miR-3175/SIX5軸調節神經膠質瘤細胞的增殖和遷移

呂旭陽 孫江川 董玥 胡林峰 錢穎 范春雷 田男

浙江中醫藥大學生命科學學院分子醫學研究所 杭州 310053

神經膠質瘤（以下簡稱膠質瘤）是中樞神經系統最常見和最具破壞性的原發性腫瘤，其發病率約占惡性腦腫瘤的80%[1]。目前治療以手術切除為主，術后配合放化療，但患者預后仍不理想，5年生存率僅為10%[2]。基因治療、免疫治療等雖然表現出良好前景[3-4]，但是分子標志物和干預靶點的篩選是其影響臨床應用的關鍵前提。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由21～23個核苷酸組成的小分子非編碼單鏈RNA，通常經由下游靶基因參與腫瘤的發生發展[5-6]。miR-3175定位于人類15染色體長臂的26.1區，研究顯示其表達異常與多種腫瘤的發生發展密切相關，包括前列腺癌[7]、胃癌[8]和肺癌[9]等。前期研究發現，miR-3175在膠質瘤細胞內表達異常。生物信息學分析進一步發現，miR-3175可能通過調控sineoculis同源異型盒同源物5（sineoculis homeobox homologue 5，SIX5）的表達來干預膠質瘤的惡性生物學行為。SIX5是SIX家族蛋白的一個成員，該家族是一組進化保守的轉錄因子[10]，在腫瘤的發生發展中具有重要作用。Liu等[11]研究發現，SIX5在非小細胞肺癌組織中表達水平明顯高于正常肺組織。然而，目前膠質瘤中miR-3175與SIX5的靶向調控機制尚未明確。因此，本研究旨在進一步研究miR-3175調控SIX5表達，從而影響膠質瘤細胞惡性生物學行為的可能機制，為診斷及治療膠質瘤提供新的研究方向。

1 材料和方法

1.1 細胞 人膠質瘤細胞系A172、U251和人正常膠質細胞系HA-1800購于中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于北京四季青生物科技有限責任公司（批號：19030603）；青-鏈霉素溶液購于吉諾生物醫藥技術有限公司（批號：70091000）；杜爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）和0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA）溶液均購于天津灝洋生物制品科技有限責任公司（批號：2021060102、20210428）；β-actin抗體購于杭州華安生物技術有限公司（批號：HM1127）；SIX5抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司（批號：00017408）；脂質體（Lipofetamine）2000轉染試劑和總RNA提取試劑（total RNA extraction reagent，TRIzol） 均購于美國Invitrogen公司（批號：2067406、135404）；噻唑藍（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）粉末購于北京索萊寶科技有限公司（批號：715F05029）；RNaseA、逆轉錄試劑盒和Ultra SYBR均購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：50423、30251、30237）；Transwell小室購于美國Corning Costar公司（批號：01020023）；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司（批號：C1062L）。

TE2000型熒光倒置顯微鏡購于日本Nikon公司；Fresco 21高速冷凍離心機和3111型二氧化碳培養箱均購于美國Thermo Fisher公司；Guava easyCyte 8型流式細胞儀為美國EMD Millipore公司產品；qTOWER3G IVD型熒光定量PCR儀購于德國耶拿分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染 細胞培養選用含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養基，所有細胞均置于5% CO2、37℃培養箱中培養。細胞轉染miR-3175 mimics和inhibitors均由百奧邁科生物技術有限公司合成。序列如下：miR-3175 mimics：5'-ACGUCACUGCGUUCUCUCUCCCCG-3'，inhibitors：5'-CGGGGAGAGAACGCAGUGACGU-3'。 將 細胞在6孔板中培養至40%～50%密度，并根據說明書使用Lipofectamine 2000進行轉染。A172與U251細胞均分別設置對照組（control）、miR-3175 mimics組（轉染miR-3175 mimics）、miR-3175 inhibitors組 （轉 染miR-3175 inhibitors）、pCDNA3.4-SIX5 組 （轉 染pCDNA3.4-SIX5），pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組（轉染pCDNA3.4-SIX5和miR-3175 mimics）。

1.3.2 RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）檢測 使用TRIzol試劑提取總RNA，并按照RNA逆轉錄試劑盒說明書，將其逆轉錄為cDNA。使用Ultra SYBR混合物進行Real-time qPCR，反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共40個循環；熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60 ℃ 15 s，1個循環。 最后通過2-ΔΔCt法分析靶基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.3.3 免疫印跡法檢測 裂解細胞并提取總蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白樣品，并轉膜。室溫下封閉2 h，4℃下一抗（稀釋比例：1:2 000）孵育過夜，以含有Tween的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline and Tween，TBST）洗滌3次。 添加二抗（稀釋比例：1:2 000），室溫下孵育2 h，以TBST洗滌3次后，采用電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）檢測試劑盒檢測。 實驗重復3次。

1.3.4 MTT法檢測 細胞增殖能力轉染48 h后，將各組細胞以每孔5×103個的密度接種到96孔板中，每組包含6個平行孔。37℃下孵育24～72 h后，各孔中加入5 mg·mL-1的MTT溶液10 μL，繼續孵育4 h后，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），以酶標儀檢測490 nm處的吸光度。實驗重復3次。

1.3.5 Transwell檢測細胞遷移能力 將孔徑為8 μm的小室放入24孔板中。每組以1×104個細胞的密度接種在含有無血清DMEM培養基的上室中，下室中填充有含20%FBS的DMEM培養基。培養36 h后，以4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗3次，光鏡下觀察，隨機挑選4個視野，20倍光鏡下拍照計數。實驗重復3次。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞周期 轉染48 h后，分別收集細胞，70%乙醇中固定過夜，離心后棄去上清液，加入PBS洗滌2次，37℃下以含RNase A的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色30 min。200 μm篩網過濾后，以流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.3.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染48 h后，分別收集細胞，PBS洗滌2次，以300 μL結合緩沖液重懸，分別進行Annexin-Ⅴ和PI染色。200 μm篩網過濾后，以流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.3.8 雙熒光素酶檢測報告基因 使用生物信息學分析軟件miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html） 和TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_71/），預測得出miR-3175的下游靶基因可能為SIX5。構建SIX5野生型 （SIX5WT-Luc）與突變型（SIX5MUT-Luc）熒光素酶報告基因質粒，分別以脂質體轉染SIX5WT-Luc和共轉染SIX5MUT-Luc與miR-3175 mimics到A172和U251細胞中，轉染48h后，檢測熒光素酶相對活性，以二者的比值作為相對表達量。實驗重復3次。

1.3.9 基因表達譜動態分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA） 從基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載膠質瘤組織和癌旁組織的基因表達數據，選擇臨床信息完善的數據進行基因表達差異分析。在癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載基因系列（gene series，GSE）4290 和GSE16011膠質瘤數據集。通過GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析以上數據，并對SIX5在膠質瘤組織和癌旁組織中的表達情況進行分析并比較。

1.4 統計學分析 采用GraphPad Prism 9.0統計軟件進行統計學分析。多組均數比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-3175在膠質瘤細胞的表達及對膠質瘤細胞增殖及遷移的影響 Real-time qPCR檢測結果顯示，miR-3175在膠質瘤細胞A172和U251中的表達水平明顯低于人正常膠質細胞HA-1800（P＜0.01）。見圖1A。

圖1 miR-3175在膠質瘤細胞中的表達和對膠質瘤細胞增殖及遷移的影響Fig.1 Expression of miR-3175 in glioma cells and effect of the proliferation and migration of glioma cells

為了探索miR-3175在膠質瘤細胞增殖中的作用，分別在A172和U251細胞中轉染miR-3175 mimics和miR-3175 inhibitors。MTT結果表明，轉染miR-3175 mimics 72 h后，A172和U251細胞存活率分別較各自對照組明顯下降（P＜0.05），而miR-3175 inhibitors組細胞存活率明顯上升（P＜0.01，P＜0.05）。 見圖1B。以上結果提示，miR-3175的表達能夠調控膠質瘤細胞的增殖。

Transwell實驗結果顯示，與對照組比較，轉染miR-3175 mimics的膠質瘤細胞穿過小室的數量較少，而miR-3175 inhibitors組膠質瘤細胞穿過小室的數量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1C。上述結果表明，miR-3175的表達能夠調節膠質瘤細胞的遷移。

2.2 miR-3175對膠質瘤細胞的周期分布及細胞凋亡的影響 與對照組比較，經miR-3175 mimics轉染后，處于G0/G1期的細胞數量明顯增加，G2/M期的細胞數量明顯減少；而miR-3175 inhibitors顯著降低了G0/G1期細胞比例，并增加了G2/M期細胞比例（P＜0.05）。見圖2A。以上結果提示，過表達miR-3175可誘導膠質瘤細胞發生G0/G1期阻滯。

圖2 miR-3175對膠質瘤細胞的周期分布及細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-3175 on cycle distribution and apoptosis of glioma cells

為了研究miR-3175對膠質瘤細胞凋亡的影響，檢測了各組膠質瘤細胞的凋亡率。轉染miR-3175 mimics的膠質瘤細胞凋亡率顯著高于各自的對照組，A172細胞凋亡率為（11.85±1.85）%，高于同一細胞對照組（7.53±1.63）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；U251細胞為（18.53±3.46）%，高于同一細胞對照組（7.80±1.13）%，差異有統計學意義（P＜0.01）。 而轉染miR-3175 inhibitors的細胞凋亡率顯著低于同一細胞對照組，A172細胞為（4.91±0.82）%，低于對照組的（7.53±1.63）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；U251為（4.58±1.60）%，低于同一細胞對照組（7.80±1.13）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2B。

2.3 SIX5是miR-3175的潛在靶基因 生物信息學軟件預測結果顯示，SIX5的3'-非翻譯區（untranslated area，UTR）區域存在與miR-3175成熟序列互補配對的結合區，提示SIX5可能是miR-3175的潛在靶基因。見圖3A。

圖3 SIX5是miR-3175的潛在靶基因Fig.3 SIX5 is a potential target gene of miR-3175

為進一步驗證兩者之間的靶向關系，首先檢測了miR-3175對SIX5蛋白表達水平的影響。免疫印跡法結果顯示，與各自對照組比較，miR-3175 mimics轉染后膠質瘤細胞中SIX5表達量明顯下調（P＜0.01，P＜0.05），miR-3175 inhibitors轉染后的SIX5表達量明顯上調（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖3B。

其次，分別在A172與U251細胞中轉染過表達SIX5，以檢測SIX5對miR-3175表達水平的影響。見圖3C。膠質瘤細胞在過表達SIX5后miR-3175的表達水平明顯降低（P＜0.01）。 見圖3D。

最后，將pmirGLO SIX5-WT或pmirGLO SIX5-MUT載體與miR-3175mimics共轉染入U251細胞中，通過熒光素酶報告基因檢測發現，與pmirGLO SIX5-MUT比較，pmirGLO SIX5-WT報告分子的相對熒光素酶活性被抑制了53%（P＜0.01）。見圖3E。上述結果表明SIX5與miR-3175的表達負相關，它是miR-3175的下游靶基因。

2.4 SIX5在膠質瘤組織中高表達且與患者預后相關為了研究SIX5在膠質瘤組織中的表達模式，對TCGALGG及TCGAGBM數據集的分析結果顯示，SIX5在膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）中的表達量顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見圖4A。與TCGA數據分析結果一致，GSE4290數據集的膠質瘤組織中SIX5的表達水平顯著增高，且與世界衛生組織（World Health Organization，WHO）分級有關（P＜0.05）。 見圖4B。 此外，對GSE16011數據集的分析結果表明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變型的腫瘤組織中SIX5基因表達明顯高于野生型（P＜0.05）。見圖4C。采用免疫印跡法檢測人正常膠質細胞以及膠質瘤細胞中SIX5的表達，結果顯示A172與U251細胞中SIX5的表達量均明顯高于HA-1800（P＜0.01）。 見圖4D。 以上結果提示，SIX5基因表達上調可能與膠質瘤的發生有關。

圖4 SIX5在膠質瘤組織中高表達且與患者預后相關Fig.4 SIX5 is highly expressed in glioma tissues and is related to patient prognosis

以SIX5相對表達量中位數為界，將TCGA數據庫中膠質瘤患者分為高表達和低表達組，生存分析結果顯示，SIX5高表達的患者總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progress free survival，PFS）均顯著低于低表達組患者（P＜0.01）。見圖4E。GSE16011數據集分析結果同樣表明，SIX5高表達的患者OS顯著低于SIX5低表達的患者（P＜0.01）。見圖4F。以上結果提示SIX5高表達可能與膠質瘤的不良預后有關。

2.5 SIX5上調降低了miR-3175 mimics抑制膠質瘤細胞增殖和遷移的作用 為了進一步驗證miR-3175是否通過靶向抑制SIX5的表達抑制膠質瘤細胞的各項惡性生物學行為，將pCDNA3.4-SIX5、pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics和miR-3175 mimics分別轉染到膠質瘤細胞。MTT結果顯示，轉染后 pCDNA3.4-SIX5組的膠質瘤細胞存活率明顯高于pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組 （P＜0.05），miR-3175 mimics組的膠質瘤細胞存活率遠低于pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖5A。 以上結果表明，SIX5的過表達削弱了miR-3175 mimics對膠質瘤細胞增殖的抑制能力。

圖5 SIX5上調降低了miR-3175 mimics對膠質瘤細胞增殖和遷移的抑制作用Fig.5 Up-regulation of SIX5 reduced the inhibitory effect of miR-3175 mimics on the proliferation and migration of glioma cells

Transwell結果顯示，pCDNA3.4-SIX5組通過濾膜的細胞數明顯高于其他組（P＜0.01），而miR-3175 mimics組通過濾膜的細胞數量明顯低于pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5B。以上結果說明，SIX5過表達削弱了miR-3175對膠質瘤遷移能力的抑制作用，提示SIX5參與了miR-3175抗膠質瘤細胞遷移的過程。

2.6 SIX5上調逆轉了miR-3175 mimics對膠質瘤細胞凋亡的促進作用 細胞周期分析結果顯示，與各自對照組和pCDNA3.4-SIX5+miR-3175mimics組比較，pCDNA3.4-SIX5組處于G0/G1期的細胞比例明顯減少，處于G2/M期的細胞比例明顯增加（P＜0.01）；而miR-3175 mimics組處于G0/G1期的細胞數比例明顯增加，處于G2/M期的細胞比例明顯減少（P＜0.01）。見圖6A。結果表明，SIX5的過表達可以緩解miR-3175 mimics對細胞周期的阻滯作用。

圖6 SIX5上調逆轉了miR-3175 mimics對膠質瘤細胞凋亡的促進作用Fig.6 Up-regulation of SIX5 reversed the effect of miR-3175 mimics on glioma cell apoptosis

pCDNA3.4-SIX5組膠質瘤細胞凋亡率明顯低于各自對照組（P＜0.05，P＜0.01）；pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組膠質瘤細胞凋亡率明顯高于pCDNA3.4-SIX5組（P＜0.01），但明顯低于miR-3175 mimics組（P＜0.01）。 見圖6B。 說明SIX5的過表達削弱了miR-3175 mimics對膠質瘤細胞凋亡的促進作用。

3 討論

膠質瘤惡性程度高、浸潤性強，往往腫瘤邊界不清，手術難以完整切除，所以常伴有不良預后。雖然隨著顯微外科的進展，以及術中磁共振及神經導航等方法的應用，膠質瘤手術治療的效果得到了一定程度的改善，并延長了患者的生存期，但術后復發率仍然較高[12-13]。因此，尋找膠質瘤預后標志物和有效的靶標分子對指導和優化治療尤其重要。

目前研究發現，miRNA通過調控其對應靶基因及下游信號通路，參與了癌癥的發生發展中的許多重要進程，包括調控腫瘤細胞遷移和生長以及誘導細胞凋亡等[14-16]。Ke等[17]發現，miR-326的過表達可以抑制成纖維細胞生長因子1（fibroblast growth factor 1，FGF1）的表達，并進一步阻斷磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB）和絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2（mitogen activated protein kinase kinase1/2，MEK1/2）通路的活性，從而抑制神經膠質瘤細胞的惡性行為。Nan等[18]研究證明，miR-451通過靶向結合鈣結合蛋白39（calcium binding protein 39，CAB39），調控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/缺氧誘導因子-1α/血管內皮生長因子（mammalian target of rapamycin/hypoxia inducible factor-1α/vascular endothelial growth factor，mTOR/HIF-1α/VEGF）信號通路，從而能夠抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲。

miR-3175定位于人類15號染色體長臂的26.1區，研究證實其在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤細胞的增殖遷移密切相關。前期研究發現，與人正常膠質細胞比較，miR-3175在膠質瘤細胞中表達下調。為驗證miR-3175是否對膠質瘤細胞惡性生物學行為有影響，本研究對膠質瘤細胞進行miR-3175過表達以及敲除，結果發現miR-3175過表達后膠質瘤細胞的增殖、遷移能力顯著降低、凋亡率顯著升高；而miR-3175敲除后細胞的增殖、遷移能力明顯升高、凋亡率明顯下降，表明miR-3175在膠質瘤中扮演著抑癌基因的作用，可以作為治療膠質瘤的潛在靶標分子。然而有報道稱，miR-3175在胃癌組織和細胞中高表達，在肺癌組織中低表達，說明miR-3175在不同腫瘤中的表達存在異質性[8-9]。

為了進一步探索miR-3175在膠質瘤中的抑癌機制，本研究采用生物信息學軟件預測發現SIX5可能是miR-3175的潛在靶基因之一。SIX5隸屬于SIX家族，該家族有6個成員，包括SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5和SIX6，在細胞增殖、分化、凋亡、黏附和遷移過程中具有重要作用[10]。目前研究發現，SIX1參與了人類多種癌癥的發生，包括胃癌[19]、乳腺癌[20]和結腸直腸癌[21]等。SIX2通過下調E-鈣黏蛋白水平，促進乳腺癌轉移[22]。SIX3的高表達則有助于改善肺腺癌患者的臨床結局，增加肺癌細胞中SIX3的表達，可以抑制細胞增殖和遷移[23]。Wei等[24]證實，SIX4蛋白豐度增高與食管鱗狀細胞癌的不良分化和浸潤深度增加密切相關。有研究表明，SIX5的表達異常可能參與1型肌強直性營養不良的發病機制[25]。降低 SIX5的表達可改善mdx小鼠的營養不良，并能夠延長其壽命[26]。Klesert等[27]還發現，缺乏SIX5會引發小鼠白內障。目前SIX5在腫瘤中研究較少，Liu等[11]的研究表明SIX5在非小細胞肺癌中表達水平明顯高于正常肺組織，但其在膠質瘤中的作用至今未有報道。本研究免疫印跡法結果發現，miR-3175可以抑制SIX5的表達。雙熒光素酶報告基因分析進一步證實，miR-3175通過結合SIX5 mRNA的3'-UTR來抑制SIX5的表達，與本研究發現在膠質瘤組織和膠質瘤細胞系中miR-3175低表達，而SIX5高表達的結果相符。此外，在膠質瘤細胞中過表達SIX5可以逆轉miR-3175對膠質瘤細胞增殖和遷移能力的抑制作用，提示miR-3175可能靶向負調控SIX5，從而抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究證實miR-3175在膠質瘤中低表達，并能夠抑制膠質瘤的惡性生物學行為，進一步證明了miR-3175靶向負調控促癌基因SIX5在調節膠質瘤增殖和遷移中的作用。本研究結果為膠質瘤發生機制提供了新的見解，miR-3175/SIX5途徑也可能成為膠質瘤靶向治療的新途徑。