基于網絡藥理學及分子對接探究補腎健脾方治療慢性乙型肝炎的作用機制

賀旻洋 李想 潘小平 周蓉 高思穎 邢宇鋒 童光東

1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院 杭州 310053 2.浙江中醫藥大學第三臨床醫學院3.浙江中醫藥大學基礎醫學院 4.廣州中醫藥大學附屬深圳市中醫院

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是指由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持續感染引起的慢性炎癥性肝病，它可逐漸發展為肝硬化和肝癌[1]。盡管干擾素和核苷類藥物等能有效地抑制HBV復制，減少HBV慢性感染并發癥，在一定程度上改善患者遠期結局，但長期服藥的要求大大降低了患者的依從性，藥物不良反應和病毒耐藥等問題限制了這些藥物的臨床應用[2]。目前臨床上尚無能完全治愈CHB的特效藥，患者預后不佳[3]。

中醫常將CHB納入“脅痛”和“黃疸”的范疇，多數中醫學家認為CHB的病機是由機體正氣不足，濕熱毒邪入侵肝臟，肝失疏泄而導致肝郁脾虛和腎精虧損等[4-7]。基于這一病因病機理論，童光東教授團隊創立了補腎健脾方[8]，該方共有14味藥。見表1。組方配伍合理，具有健脾補腎、清熱解毒、活血利濕等功效，臨床研究顯示其對CHB療效顯著[9-10]。研究證實，補腎健脾方能調控Th1/Th2型細胞因子水平，調節機體免疫功能，抑制體內HBV復制[11]。此外，還有研究發現補腎健脾方與抗病毒藥物具有協同作用，該方不僅能減輕干擾素不良反應，降低白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）和白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）水平，還能促進乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen，HBeAg）血清學轉換，改善患者臨床癥狀，增強療效[9，12]。然而，補腎健脾方治療CHB的作用機制尚未完全明確。本研究采用網絡藥理學和分子對接技術探究補腎健脾方治療CHB的藥理作用機制，為臨床應用補腎健脾方治療CHB提供理論支持。

表1 補腎健脾方的構成Tab.1 Constitution of Bushen Jianpi Decoction

1 材料和方法

1.1 補腎健脾方的活性成分篩選 登錄中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https://tcmspw.com/），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，搜集補腎健脾方中淫羊藿、菟絲子、杜仲、懷牛膝、黃芪、白術、茯苓、豬苓、枳殼、丹參、三七、郁金和枸杞子的化學成分，并去除部分作用靶點研究尚不明確的化合物。登錄中藥分子機制生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）網站（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），以score cutoff≥20，P＜0.05為篩選參數，結合文獻[13]對葉下珠的活性成分進行選擇和補充。

1.2 補腎健脾方活性成分作用靶點收集及藥物-活性成分-靶點網絡構建 從TCMSP數據庫中收集活性成分的相關作用靶點，并在UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）中將靶點名稱轉換為對應的人類基因名稱。匯總整理藥味名稱、活性成分和基因名稱，導入Cytoscape 3.7.0軟件，構建藥物-活性成分-靶點網絡，使用Network Analyzer工具計算各活性成分節點度值，尋找補腎健脾方的核心活性成分。

1.3 補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點預測及蛋白互作（protein-protein interaction，PPI） 網絡構建登錄疾病相關的基因與突變位點數據庫DisGeNET（https://www.disgenet.org），收集CHB的疾病靶點基因。并將其與補腎健脾方活性成分的相關作用靶點共同導入交互式韋恩圖查看器Jvenn平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html）進行韋恩分析，兩者的交集靶點即為補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點。將潛在作用靶點上傳至STRING數據庫（https://string-db.org），以“Homo sapiens”為限定基因物種，進行PPI分析，運用Cytoscape 3.7.0軟件，構建PPI網絡圖，按節點度值的高低篩選核心靶點。

1.4 富集分析 將潛在作用靶點導入DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），在數據庫內進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，分別以柱狀圖和氣泡圖顯示GO和KEGG富集結果。

1.5 分子對接 在TCMSP、Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和蛋白質數據庫（Protein DataBank，PDB）平臺（https://www.rcsb.org）下載藥物-活性成分-靶點網絡中節點度值前10的藥物活性成分和潛在作用靶點度值排名前3的核心靶點的3D立體構像文件。運用OpenBabe軟件轉換文件格式；運用Pymol軟件去除水和配體等進行預處理。隨后導入AutoDock進行結合能評分，并利用Pymol建立對接相互作用模式圖。

2 結果

2.1 補腎健脾方活性成分的篩選及藥物-活性成分-靶點互作網絡的構建 以OB≥30%和DL≥0.18為條件，在TCMSP軟件內篩選出補腎健脾方各藥味活性成分：淫羊藿23個、菟絲子10個、杜仲26個、懷牛膝15個、葉下珠4個，黃芪17個、白術4個、茯苓6個、豬苓7個、枳殼5個、丹參59個、三七7個、郁金3個、枸杞子35個。 合并重復項后共得到188種活性成分，其中包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（Luteolin）等。應用TCMSP數據庫查詢藥物活性成分的作用靶點，構建藥物-活性成分-靶點網絡圖。見圖1。圖中共含有530個節點 （包含14個藥味節點、188個活性成分節點、328個藥物作用靶點節點）和4 709條網絡通路。度值排名前20的活性成分見表2，這些成分可能是補腎健脾方治療CHB的核心活性成分。

圖1 補腎健脾方藥物-活性成分-靶點網絡Fig.1 Bushen Jianpi Decoction drug-active component-target network

表2 補腎健脾方度值排名前20的活性成分基本信息表Tab.2 Basic information of the top 20 active ingredients of Bushen Jianpi Decoction

2.2 補腎健脾方對CHB的潛在作用靶點 利用DisGeNET數據庫收集得到CHB靶點415個，通過韋恩分析得到補腎健脾方活性成分靶點與CHB的疾病靶點的交集。見圖2。共有57個藥物-疾病交集靶點基因，分別為白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血清白蛋白（albumin，ALB）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-4等，這些交集靶點是補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點。

圖2 補腎健脾方與CHB的靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets in Bushen Jianpi Decoction and CHB

2.3 PPI網絡 將藥物-疾病交集靶點導入STRING數據庫，查詢靶點之間的相互作用關系，剔除1個孤立節點后將結果導入Cytoscape 3.7.0，按度值大小對其進行可視化處理，構建補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點的PPI網絡圖。見圖3。圖中共有56個節點和788條邊，靶點度值越高，則節點越大，顏色越藍。度值最高的靶點主要為IL-6、ALB、TNF等，這些靶點可能為補腎健脾方治療CHB的核心靶點。

圖3 PPI網絡Fig.3 PPI network

2.4 GO功能富集分析 利用DAVID網站對57個藥物-疾病交集靶點進行GO富集分析，以P＜0.05為篩選條件，共收集到GO條目328條。見圖4。其中273條生物過程（biological process，BP）相關條目，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控、炎癥反應等；17條細胞組分（cellular component，CC）相關條目，包括細胞外間隙、胞外區等；38條分子功能（molecular function，MF）條目，主要涉及細胞因子活性、轉錄因子結合等。由此可見，補腎健脾方治療CHB相關的靶標主要富集于細胞外間隙、胞外區等細胞組分及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控、炎癥反應、轉錄因子結合、細胞因子活性等生物功能。

圖4 補腎健脾方治療CHB潛在作用靶點的GO分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets of Bushen Jianpi Decoction in the treatment of CHB

2.5 KEGG通路富集分析 以P＜0.05為篩選條件，在DAVID數據庫中共富集到63條KEGG通路，其中涉及TNF信號通路（TNF signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway，TLR signaling pathway）等。P值排名前25的KEGG通路富集結果見圖5。

圖5 補腎健脾方潛在作用靶點KEGG通路富集分析Fig.5 Pathways of potential targets of Bushen Jianpi Decoction by KEGG enrichment analysis

2.6 分子對接分析 將本研究中節點度值排名前10的核心活性成分分別與3個核心靶點（IL-6、ALB和TNF）進行分子對接。見表3。其中絕大多數分子對接的結合能都小于-5 kJ·mol-1，提示核心活性成分能與核心靶蛋白良好結合，形成較穩定的結構，這是藥效可以有效發揮的前提。各味中藥中核心化合物與3個核心靶點結合的最低結合能Pymol三維模式圖見圖6。

表3 補腎健脾方部分活性成分分子對接結果Tab.3 Molecular docking results of some active components in Bushen Jianpi Decoction （kJ·mol-1）

圖6 分子對接模式圖Fig.6 Molecular docking patterns

3 討論

中醫藥治療CHB具有獨特的優勢，補腎健脾方、疏肝理脾、扶正抗毒方等代表方劑治療CHB均取得了良好療效[8，14-15]。研究證實，補腎健脾方可顯著降低HBV DNA水平，提高HBeAg血清學轉換率，降低Knodell組織學活動指數和Ishak纖維化評分，改善預后][16-17]]。

本研究發現，槲皮素、山奈酚、木犀草素等核心活性成分的潛在作用靶點多，且能與3個核心靶點良好結合，可能是治療CHB的主要成分。槲皮素、山奈酚、木犀草素同屬黃酮類化合物，皆具抗炎、抗病毒、護肝的生物活性[18]。槲皮素可以顯著降低乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）和HBeAg的表達，抑制熱休克蛋白40（heat shock protein 40，HSP40）轉錄和HBV復制。山奈酚不僅能抑制肝細胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）表達，恢復超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶的活性，減輕肝細胞的氧化應激損傷；還可顯著下調血清TNF-α和IL-6的水平，減輕肝臟炎癥反應損傷[19]。木犀草素可抑制蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和Smad蛋白磷酸化，顯著抑制肝星狀細胞的激活，促進已活化的肝星狀細胞凋亡，發揮抗肝纖維化的作用[20]。這些結果提示，補腎健脾方可能通過抗炎、抑制HBV復制、抗氧化、抗纖維化等多途徑實現治療CHB的目標。

本研究通過PPI網絡拓撲分析得到IL-6、ALB、TNF等核心靶點，分子對接結果顯示這些靶點與核心活性成分結合良好，可能是補腎健脾方治療CHB重要靶點。IL-6是重要的免疫調節因子，與肝臟炎癥損傷密切相關，可作為評估和監控CHB病情發展的敏感指標[21]。IL-6可通過上調細胞因子信號傳導因子3的表達，降低干擾素-α（interferon-α，IFN-α）下游效應因子黏病毒抗性蛋白A和雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R的表達，削弱IFN-α的抗HBV效應，導致CHB患者對IFN類藥物產生耐藥[22]。研究還發現，激活IL-6可誘導IL-4基因表達，促進CD4+T細胞向Th2亞群分化，下調Th1細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ） 基因表達[23]。既往臨床研究均顯示，補腎健脾方能顯著降低IL-4、IL-10等Th2細胞因子水平，提高Th1細胞因子IFN-γ水平[9，11，24]，與文獻報道中抑制IL-6的激活所產生的生物學效應相似，提示補腎健脾方可通過抑制IL-6及其信號通路，從調節機體免疫反應、增強IFN抗病毒效應、減少耐藥等方面增強抗病毒藥物對CHB的療效。

ALB由肝臟合成，既可上調谷胱甘肽水平，中和自由基而發揮抗氧化作用，還可抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，下調血管細胞黏附分子表達，抑制單核細胞黏附，減輕肝細胞炎癥損傷[25]。TNF-α是一種促炎細胞因子，可誘導肝臟炎性損傷，CHB患者血清TNF-α水平可反映肝細胞損傷程度[26]。這些結果揭示，補腎健脾方可能作用于多靶點，調控炎癥反應，發揮治療CHB的作用。

GO富集結果表明，補腎健脾方治療CHB可能與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控、炎癥反應和細胞因子活性等生物功能相關，提示該方可能通過調控HBV轉錄和復制、抑制肝細胞凋亡和調節免疫等方面影響CHB的發生發展。KEGG富集分析發現，TNF信號通路和TLR信號通路是補腎健脾方治療CHB的關鍵通路。其中TNF-α信號通路是重要的炎癥通路，抑制TNF-α通路可有效減少肝細胞壞死，抑制肝星狀細胞的激活，改善患者預后[27-28]。研究發現，慢性HBV感染者體內HBV特異性TNF-α+T細胞的細胞頻率與肝損傷的嚴重程度密切相關，而IFN-γ+T細胞的細胞頻率與病毒清除率呈正相關，TNF-α+T細胞向IFN-γ+T細胞分化將有利于HBV病毒的清除[29]。前期研究顯示，補腎健脾方能夠顯著提高IFN-γ水平[9，11，24]，提示補腎健脾方可能通過參與TNF-α+T細胞向IFN-γ+T細胞分化過程的調控，調節TNF通路。

TLR是一種模式識別受體，對于識別病原體以及啟動免疫應答至關重要[30]，活化TLR可用于CHB的免疫治療[31]。 激活Toll樣受體7（Toll-like receptor 7，TLR7）可顯著誘導IFN-α生成，抑制HBV復制，降低血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平[32]。 TLR7的激活還可促進CD8+T淋巴細胞活化，啟動免疫應答，清除HBV[33]。TLR2在增強HBV特異性CD8+T細胞功能的同時，能激活NF-κB等炎癥通路，誘導促炎細胞因子產生，介導固有免疫反應，抑制HBV復制[34-35]。由此可見，通過炎癥及模式受體通路減輕炎癥和抑制HBV復制是補腎健脾方治療CHB的機制之一。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學和分子對接方法明確了補腎健脾方含槲皮素和山奈酚等活性成分，可能通過調節IL-6等靶點以及TNF和TLR等信號通路發揮治療CHB作用。該結果為補腎健脾方的臨床應用提供了理論支持，也為相關分子機制的進一步闡明奠定了基礎。