松蘿提取物對CIA大鼠HMGB1介導的炎癥因子表達的影響

雷玉梅,安陽,張軍,徐暉,陸道敏,曹躍朋,寧喬怡,王瑩

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550002)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節滑膜炎為主要病理特征的慢性疾病，滑膜炎是RA病情發展致殘的重要因素。

高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein,HMGB1)是近年來發現的一種促炎中介，它可誘導及參與炎癥的發生與發展，在自身免疫性疾病中可能具有十分重要的作用。研究證實，HMGB1在類風濕關節炎患者血清、滑膜液中存在且異常增高[1-2]；HMGB在RA炎癥的持續過程中發揮著重要作用。HMGB與TLR2、TLR4受體結合，誘導TNF-α、IL-1β等致炎因子釋放[3-4]導致炎癥持續,造成關節破壞，這些炎性因子又能促進HMGB1的釋放[5]，以此形成一個正向炎癥反饋通路。

侗醫藥松蘿具有祛風除濕、通絡止痛的功效。經課題組前期研究證實松蘿提取物對RA的治療具有良好療效[6]。經動物實驗證實松蘿能緩解CIA模型大鼠的關節腫脹情況并能抑制NF-κB的蛋白活性[7-8]。因此，在前期研究的基礎上，本研究提出HMGB1介導的細胞炎癥是RA患者關節滑膜炎癥發生、發展的關鍵因素，侗醫“趕邪、消水”理論指導下的侗族藥松蘿提取物可能通過調控HMGB1介導的炎癥反應，抑制RA關節滑膜炎癥的科學假說，具有充分的理論依據和堅實的前期研究基礎。為驗證此假說，本研究從動物實驗探討松蘿提取物通過HMGB1炎癥通路調控RA炎癥因子的分子機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗器材及試劑

儀器：全自動酶標儀(Thermo scientific，Multiskan MK3)，PCR儀(東勝創新生物科技有限公司，EDC-810)，垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-40)等。試劑：磷酸酶抑制劑(碧云天，S1873)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，P0010)，RIPA裂解液(碧云天，P0013B)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物及分組

SPF級5周齡Wistar雌性大鼠54只，體質量150～180 g,購自湖北省實驗動物研究中心，動物合格證號:SCXK(鄂)2020-0018，喂養環境室溫20～25 ℃、濕度70%左右，自由進食、自由飲水，適應環境1周后開始試驗。按隨機數字表進行編號，隨機分為松蘿提取物低、中、高劑量組和羥氯喹組、空白組、模型組[1]，每組9只。

1.2.2 模型的制備

將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的醋酸中，攪拌溶解，配制成2 mg/mL溶液，置4 ℃冰箱過夜。與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化配制成Ⅱ型膠原乳劑，分別于大鼠尾根部多點皮內注射0.1 mL致炎，復制穩定的CIA大鼠模型[9]。造模成功評價：采用關節炎評分法，即造模成功的大鼠趾端至踝關節段紅腫，關節炎癥評分>4分[10]。

1.2.3 給藥劑量

根據課題組前期的藥代動力學研究結果，本研究的給藥劑量為松蘿提取物6 mg/kg為中劑量，其1/3劑量(2 mg/kg)為低劑量，9倍劑量(54 mg/kg)定為高劑量。羥氯喹成人用量400 mg/日，參照60 kg成人與動物藥物劑量換算系數表，大鼠用藥劑量(mg/kg)=5.4×人用藥劑量(mg/kg)[11]。

1.2.4 樣品采集

末次灌胃2 h后，以烏拉坦按0.4 mL/100 g的劑量，經腹腔注射麻醉后，股動脈取血4～6 mL，室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，提取血清。處死大鼠后，取大鼠后右足踝關節，取出滑膜組織，提取組織蛋白。

1.2.5 ELISA法檢測血清致炎因子

ELISA法檢測IL-23、IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌。按照試劑盒設空白孔、標準孔、待測樣品孔,分別加樣，36 ℃孵育90 min，洗板5次，加入酶標試劑，36 ℃反應，溫育1 h，洗板5次，加入TMB 100 μL，覆膜36 ℃避光，溫育15 min，后加入終止液，測量OD值，進行計算。

1.2.6 HMGB1、TLR4與TLR2 mRNA表達檢測

采用PCR法檢測TLR2、TLR4與HMGB1表達量。提取總RNA,逆轉錄合成cDNA，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 sec，60 ℃30 sec，40 cycles。引物設計如下，β-actin：(F)5’- CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC -3’，(R) 5’- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3’;TLR2:(F)5’-GGAAGCAGGTGACAACCATT-3’,(R)5’-CGCCTAAGAGCAGGATCAAC-3’;TLR4:(F)5’-TGGTGGCTGTGGAGACAAAAATGAC-3’(R)5’- CTGAAAGGCTTGGGCTTGAATGGAG-3；每個樣本3個副孔，重復3次。

1.2.7 Western Blot法檢測HMGB1、TLR2與TLR4蛋白表達量

將少量剪碎的組織塊置于2 mL EP管中，加入洗凈的鋼珠，裂解、勻漿，置于冰上30 min。用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管。以BSA為標準，進行蛋白濃度測定。沸水浴10 min將蛋白變性。10% SDS-PVDF電泳，各樣品總蛋白量為40 μg。加樣后先恒壓80 V電泳至溴酚藍指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120 V至溴酚藍到凝膠底部，此過程約用時1.5 h。封閉2 h。一抗4 ℃過夜，二抗孵育2 h。將ECL試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，反應數分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 松蘿提取物對CIA大鼠血清中HMGB1含量的影響

與空白組比較，松蘿提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組、羥氯喹組及模型組的HMGB1含量均增高(P<0.05)，與模型組相比較,不同濃度的松蘿提取物、羥氯喹組均可降低HMGB1含量(P<0.05)；松蘿中劑量組、高劑量組與羥氯喹組相比降低HMGB1的效果相當，無顯著差異，見表1。

表1 松蘿提取物對CIA大鼠血清中HMGB1含量的影響

2.2 松蘿提取物對CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-23與IL-6含量的影響

與空白組比較，松蘿提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、羥氯喹組的IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α含量均增加(P<0.05)；與模型組比較，松蘿提取物中劑量組、高劑量組及羥氯喹組均能降低TNF-α、IL-23、IL-1β、IL-6含量(P<0.05)，松蘿中劑量組、高劑量組與羥氯喹組相比，差異無統計學意義，見表2。

表2 松蘿提取物對CIA大鼠血清中IL-6、IL-23、IL-1β、TNF-α含量的影響

2.3 RT-PCR法檢測CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR4與TLR2 mRNA的表達

與空白組相比較，松蘿提取物低、中、高劑量組與模型組、羥氯喹組HMGB1、TLR4、TLR2 mRNA表達均增加(P<0.05)；與模型組相比較，松蘿提取物中、高劑量組及羥氯喹組均能抑制 mRNA表達(P<0.05)；與羥氯喹組相比較松蘿提取物中、高劑量組抑制HMGB1、TLR4、TLR2表達的效果相當，見表3。

表3 松蘿提取物對CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR2、TLR4 mRNA表達的影響

2.4 Western Blot法檢測CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR2與TLR4蛋白的表達量

與空白組相比較，松蘿提取物低、中、高劑量、模型組、羥氯喹組表達均增加(P<0.05)；與模型組相比較，松蘿提取物中劑量組、高劑量、羥氯喹組均能抑制HMGB1、TLR4、TLR2表達(P<0.05)；與羥氯喹相比較，松蘿中劑量組、高劑量組在抑制蛋白表達上無顯著差異,見圖1，表4。

圖1 各組CIA大鼠滑膜組織HMGB1、TLR2與TLR4蛋白表達條帶圖

表4 松蘿提取物對CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR2、TLR4蛋白表達的影響

3 討論

RA是一種自身免疫性疾病，發病因素復雜，其中滑膜炎癥是其主要病理表現。當人體出現刺激或免疫損傷的情況下，HMGB1作為促炎因子從細胞核內釋放，通過與RAGE、TLR2及TLR4受體結合，促進IL-6、IL-23等的分泌，誘導TNF-α、IL-1β等致炎因子釋放[3-4]，這些炎癥因子又可以反過來促進HMGB1 的釋放而形成持續的炎癥反應。有研究[13]發現 RA 患者與健康人相比較，血清中 HMGB1含量明顯升高，活動期的RA患者與非活動期RA患者相比較，血清中HMGB1水平增高，提示HMGB1可能與疾病活動相關。動物實驗發現將重組HMGB1蛋白注射進大鼠關節腔可引起滑膜炎，給CIA大鼠模型注射HMGB1抗體干預后，滑膜炎癥減輕[1]。TLR屬于跨膜蛋白，是HMGB1的特異性受體，在炎癥信號傳遞中有著重要作用。研究發現，HMGB1可被TLRs識別，參與免疫應答過程[14]。在小鼠或者大鼠關節腔內注射TLR配體如細菌DNA，LPS等可誘導關節炎癥的發生，LPS與Ⅱ型膠原聯合進行關節腔內注射可加重關節炎癥反應，而敲除TLR2、TLR4的動物表現出炎癥程度明顯下降。IL-6、IL-23、TNF-α、IL-1β是RA病程中的主要促炎因子[15-16]。HMGB1可以通過激活NF-κB信號通路誘導炎癥因子的釋放。本研究證實，松蘿提取物具有較好的抗炎作用。中劑量及高劑量組的松蘿提取物可有效減輕CIA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α、HMGB1的濃度，以及滑膜細胞中 HMGB1、TLR2、TLR4蛋白表達。

綜上所述，松蘿提取物能降低HMGB1、TLR2、TLR4 mRNA的表達量，并抑制HMGB1、TLR2、TLR4的蛋白表達，減少IL-6等細胞因子的含量，阻斷HMGB1/TLR炎癥通路，從而減輕RA滑膜炎癥，達到控制關節炎的目的。