無菌動物在腸道微生物組學研究中的應用研究現狀

朱 茜 譚 向 武志峰 楊亞鵬 程 偉 魏 泓

(華中農業大學動物科學技術學院無菌動物平臺，武漢 430070)

腸道微生物群是動物體最大的微生物群，據估計成人腸道內的微生物共有1014個，接近人類體細胞數量的10倍，而且其編碼基因數量比人類基因組多100倍[1]。腸道微生物被視為機體重要的“功能器官”，與營養代謝、免疫調節等諸多生理過程密切相關。它可代謝經宿主初級消化后殘余的蛋白質、碳水化合物、氨基酸、脂質、多酚類等[2-4]營養物質，為機體提供可利用的營養素，如多種維生素，還能依賴其代謝產物通過介導共生菌群與宿主免疫系統相互作用來協調腸道穩態，而腸道穩態是保障機體正常發育與維持健康的關鍵。自出生起，微生物群就開始在胃腸道中定植，其組成、分布等構成了復雜的腸道生態系統。益生微生物可與腸道黏膜黏附、嵌合和結合，形成菌膜屏障結構，通過競爭黏膜位點定植、競爭營養物、代謝物抑制、促進宿主免疫等方式抑制腸道內病原菌入侵[5]，這對維持宿主腸道穩態至關重要。腸道微生物產生的代謝物，如短鍵脂肪酸、色氨酸、牛磺酸等，可通過調節受體表達[6]、激活轉錄因子、增加屏障保護作用相關細胞因子的表達或直接調節腸上皮通透性相關連接蛋白的表達等來影響腸上皮屏障功能[3]。膽汁酸也可以調節腸道黏膜免疫細胞，保護腸上皮細胞并對艱難梭菌等病原體有抵抗力[7]。不僅如此，腸道微生物在誘導IgA產生和維持腸道各種T細胞群的內環境穩定也起關鍵作用[8]。此外，已有眾多研究發現腸道微生物與骨質量[9]、神經系統[10]、心血管系統[11]、生物節律[12]等有關。伴隨著腸道微生物因具有重要生物學作用而成為近年的研究熱點，無菌動物作為腸道微生物組學廣泛而深入研究必不可少的核心工具，也越來越受到科研工作者的關注與重視。

1 無菌動物技術體系的建立

無菌動物是利用現有檢測方法檢測不到任何活微生物和寄生蟲的動物。無菌動物概念最早由Louis Pasteur于1885年提出[13]，直到20世紀30年代，隨著無菌隔離器的研發，無菌動物技術才得以發展。

無菌胎生動物通常通過子宮切除術或者胚胎移植實現，無菌家禽則通過蛋殼表面滅菌獲取，獲取的無菌動物將被終身飼養于無菌隔離器中。1928年，Reyniers研制出不銹鋼無菌動物隔離器[14]，之后，Trexler發明了塑料薄膜隔離器，它的制作成本僅為原來的1/10[15]。飼養成本下降和相關需求提升使得無菌動物的飼養量大幅提高。實際上，自20世紀50年代以來，無菌動物技術都沒有太大變化[13,16]。作為無菌動物的典型代表，無菌小鼠因需求量大與應用廣泛，其飼料營養研究與實驗操作技術等都得以重視，因此無菌小鼠技術體系在國內外均相對成熟，但在制備技術與檢測方法等方面仍有待提升。

無菌動物是檢驗宿主與微生物相互作用的重要工具，其中無菌化的基因工程小鼠可以用于研究宿主特定基因與微生物群之間的相互作用；另外，無菌動物的菌群或菌株移植模型更是為理解宿主-菌群或菌株相互作用關系和疾病相關的微生物影響因素提供了巨大的幫助。因此，無菌動物已成為研究微生物組的“金標準”模式動物。

2 無菌動物應用于腸道微生物組學研究

2.1 無菌動物應用于畜牧微生物組學研究

在畜牧生產中，微生物組研究有助于更加全面地了解宿主、微生物、食物及病原體等相互作用關系，有助于開發飼料產品、防治畜禽疾病、改良生產性狀和拓展飼養策略等。

飼用抗生素最早追溯到上世紀中葉，由于它擁有促進生長和控制疾病的功能，被廣泛使用到畜牧業生產實踐中。用無菌雞進行的實驗發現[17]抗生素的促生長作用可能來源于其抗菌作用。目前，抗生素的促生長作用主要通過調節腸道微生物來實現的觀點已被普遍認可，有研究表明，抗生素對無菌動物的生長性能沒有任何顯著的益處[18-20]，而經過低劑量抗生素選擇的菌群顯示促生長表型可以通過菌群移植轉移到無菌動物身上[21]。有關抗生素替代物，如益生菌等的篩選與評價可利用無菌動物進行驗證，有研究[22]建立了一種悉生雞模型，并表示該模型適合于研究雞腸道菌群的作用機制以及確定益生菌的安全性和有效性等應用評價。

在動物疾病方面，利用無菌動物構建疾病模型可減少干擾因素，以便于了解病征、分析致病機制并研究防治方法。豬捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)是一種僅感染豬的病毒，該病毒的非致病性菌株常見于家豬體內，所以獲取非病毒攜帶者用于致病菌株疾病研究相對困難[23]。有研究[24]發現通過SPF豬無法建立合適的疾病模型，但在之后的研究中，他們利用無菌豬成功構建了PTV模型，誘發了非化膿性腦脊髓炎為特征的中樞神經系統疾病，并證實了PTV在受感染豬體內的分布，該模型具有作為PTV發病機制研究模型的價值[25]。事實上，無菌動物在人類疾病醫學上的研究應用更為廣泛。

動物生長繁殖等經濟性狀與腸道菌群也存在相關性。有分析[26]發現脂肪型榮昌豬和瘦肉型約克夏豬的腸道菌群分布特點、骨骼肌纖維特性和脂質代謝特征均存在顯著差異，利用無菌小鼠接種兩者的腸道菌群發現受體小鼠表現出與供體相似的骨骼肌纖維特征及脂質代謝特征，有研究[27]利用無菌小鼠證實腸道菌群移植可以將不同品種豬的腸道特征部分轉移給小鼠。與商品雜交仔豬相比[28]，從江小型仔豬對早期斷奶應激性腹瀉的抵抗力更強，并分析了腸道菌群組成差異，通過無菌小鼠糞菌移植實驗確定和驗證了L.gasseri-LA39和L.framenti是介導腹瀉抗性的兩種關鍵功能株菌。有研究[29]發現患乳腺炎奶牛的糞菌移植到無菌小鼠體內可誘導其出現乳腺炎癥狀，以及血清、脾和結腸炎癥，而益生菌攝入有助于減輕接種小鼠的乳腺炎病癥，表明恢復腸道菌群功能的益生菌可能是治療奶牛乳腺炎的潛在策略。以上研究均提示我們畜牧微生物作為內在環境因素，與其生長繁殖、抗病力等經濟性狀密切相關，這些重大發現為改良畜禽經濟生產性狀提供了新思路、新途徑。

2.2 無菌動物應用于營養微生物組學研究

腸道微生物在動物營養代謝過程中發揮了至關重要的作用，營養代謝性疾病，如肥胖癥、兒童營養不良、食物過敏、糖尿病等都與其緊密相關。

有研究[29]將肥胖志愿者菌群移植到無菌小鼠體內成功重現受體小鼠肥胖表型的實驗揭開了現代微生物組學研究的序幕。無菌嚙齒動物被多次用于研究腸道菌群與肥胖之間的因果關系。已有大量研究發現，腸道菌群能影響宿主能量攝入、脂肪儲存和食欲等[30]。盡管發現特征菌群可以導致肥胖，調節腸道菌群可作為治療肥胖癥的一種途徑，但飲食組成的影響也不可輕視。有研究[31]用不同日糧飼喂無菌和常規小鼠發現，腸道菌群缺乏依舊不能避免飲食誘導的肥胖，腸道產物空腹誘導的脂肪因子/血管生成素樣蛋白4 (Fiaf/Angptl4)與腸道菌群介導的脂肪存儲沒有必然因果關系，而以往研究認為Fiaf/Angptl4是一種脂蛋白脂肪酶抑制劑，腸道菌群可以使其減少，從而促進脂蛋白脂肪酶分解的脂肪酸在宿主脂肪組織中儲存[32]。

在許多發展中國家，兒童營養不良是公認的主要公共衛生問題。營養不良兒童的腸道菌群發育受損，而且菌群移植實驗證實了營養不良的生長表型可由腸道菌群介導，腸道菌群的不成熟與兒童營養不良有因果關系[33]。有研究[34]發現構建與年齡相符的成熟微生物組是治療兒童營養不良的關鍵，利用無菌小鼠和無菌豬構建悉生動物模型，并結合多組學研究技術發現可促進腸道菌群成熟的食物組合。此外，兒童營養不良或伴有腸道感染，如人類輪狀病毒(human rotavirus,HRV)是營養不良兒童腹瀉的主要病因。有研究[35]建立了首個健康2月齡嬰兒糞菌移植的新生豬模型，并發現蛋白營養不良加劇了HRV感染，并影響小腸上皮屏障的形態和功能。

除兒童營養不良，食物過敏癥的發病率在過去50年里急劇增加，特別是在發達國家[36]。為了更好地理解共生菌對人類食物過敏癥狀的調節機制，有研究[37]將健康嬰兒和牛奶過敏嬰兒的糞便分別移植無菌小鼠，發現健康嬰兒的菌群可預防小鼠發生牛奶過敏，而牛奶過敏嬰兒的菌群無此保護作用，并鑒定出產生丁酸的梭菌屬細菌——糞厭氧棒狀菌對牛奶過敏起保護作用。腸道細菌對于調節飲食抗原的過敏反應至關重要，這提示調節細菌群落的干預措施可能與食物過敏相關。此外，有研究[38]發現飲食中過量攝入脂肪引起的微生物群落改變可能增加食物過敏的易感性。總言之，調節腸道微生物或許可成為治療食物過敏的一種新策略[39]。

另外，隨著營養學研究的深入發展，人們發現人類對飲食攝入的不同反應可能由獨特的、可量化的宿主及微生物群落特征所驅動。基于個性化的宿主-微生物-飲食作用關系的精準營養策略將在改善人類健康方面作出巨大貢獻[40]。無菌動物的相關應用研究證實了微生物組學在精準營養研究中的作用，這將進一步推動無菌動物開發應用與精準營養微生物組學的“合作共贏”。

3 制約無菌動物技術體系發展的因素

盡管無菌動物技術現存已久，但是目前在我國，無菌動物存在生產規模小、效率低、運輸受限等困境。此外，無菌動物應用和研究體系分離都限制了無菌動物體系的發展、無菌動物技術的普及和應用。

3.1 制備門檻和飼養要求高

無菌化制備過程是獲取不同品系或不同基因工程化無菌動物的關鍵環節。目前，無菌哺乳動物制備方法主要分為子宮切除法和胚胎移植法。利用子宮切除法制備無菌小鼠時，手術時間難以把握，偏早仔鼠不易成活，偏晚則容易造成微生物污染；此外，該方法獲得的仔鼠離乳率也較低。利用胚胎移植法制備無菌動物因技術要求較高，目前正處于初步研究階段，尚未應用于無菌動物實際生產制備。

無菌動物的飼料營養問題也是制約無菌動物體系發展的重要因素之一。動物機體的代謝、消化等各個方面都存在差異，導致無法精確供給無菌動物營養。目前，國內外均沒有無菌動物統一的營養需求標準，關于無菌動物的營養需求和供給只能依賴于每個團隊自身探索研究，并形成各自保密的營養配方。

有研究充分記錄了第一批無菌大鼠飼養成功過程，展現了無菌動物的飼養難度[41]。由于前人的經驗積累，對于已有無菌動物品系的建立已經相對容易，但對于新的品系和物種，無菌個體的獲取及人工喂養等都存在諸多困難，有待克服。以上因素均在不同程度上制約了無菌動物的開發與應用，最終導致無菌動物技術體系的發展嚴重滯后，遠遠無法滿足腸道微生物組以及其他微生物組學發展所需。

3.2 維持成本高

無菌動物體系對外在飼養環境與內在物料供應均要求嚴格。外界飼養環境最好控制在萬級及以上潔凈程度，而且需要不定時監測與消毒滅菌處理，這樣才能盡最大可能降低污染的風險，保證高效生產。相比外在環境潔凈度控制，無菌動物的飼料、飲水、墊料等物料物品的潔凈等級要求更高，必須經過更加嚴格的滅菌和檢測合格(即無菌狀態)后才可以使用，否則極易造成污染。一旦污染，損失巨大，因此無菌動物實際生產需要大量訓練有素的技術人員，然而實際工作中并沒有專門化的人員可供招聘，這勢必導致人員培訓與薪資待遇費用上漲。無菌動物的運輸相較一般動物來說條件更苛刻，此外，無菌動物的規模維持、微生物檢測等都要損耗大量的人力、物力、財力。

總之，無菌動物體系從外到內，從技術人員要求到遠程運輸使用等每一步相較于常規動物而言都是升級，因此無菌動物體系整個維持費用成指數增長，這必然制約了無菌動物體系的開發與應用。

3.3 配套體系不完善

無菌動物模型是微生物組學研究的核心工具，除了自身體系建設所需設施設備有待更新改進，相關配套體系的建設也不容忽視。

近年來，盡管無菌動物隔離設備的研發、生產與使用都得到相關企業的重視與大力發展，然而仍存在功能單一、用戶體驗不理想、智能化程度低等問題，而且國內嚴重缺乏無菌動物隔離設備研發生產的大規模商業化公司，這不僅導致競爭力低下而單臺隔離設備價格高昂，也使得隔離設備研發進展嚴重遲緩。此外，無菌動物平臺在微生物組學研究方面目前只限于模型開發與應用，與后續的分析測試等配套系統幾乎完全脫離，因此整合無菌動物平臺與多組學檢測分析平臺，打造無菌動物開發應用以及檢測分析的一體化技術服務平臺將更有利于無菌動物體系的優化升級、推廣與應用。

4 展望

微生物組學研究與發展離不開無菌動物的進一步開發應用，其中腸道功能微生物組學研究更是如此。無菌動物制備技術整合基因工程技術、菌群或菌株移植技術，再結合表型測定與多組學檢測方法，可探究不同品種或個體的腸道菌群組成結構和功能同重要表型性狀的相關性及因果關系，也為篩選驗證關鍵功能菌群或菌株提供關鍵模型。在醫學研究領域，無菌動物的廣泛應用可積極推動人類重大疾病微生物組研究及其精準醫學藥物產品研發，如基因與微生物相互作用對重要疾病表型發生發展的影響、腫瘤精準生物治療；在畜牧生產領域，無菌動物的研究應用可積極推動畜牧生產中的重要動物疾病、重要經濟生產性狀相關微生物組學的深入研究及其應用產品研發，如開展腸道菌群靶標活性飼料研發、加強腸道菌群靶標健康養殖研發[42]。隨著微生物基礎研究的厚積薄發，功能微生物組學將不斷煥發新的活力，無菌動物技術體系的進一步開發與應用也將不斷被重視，無菌技術不斷更新發展，逐步形成產、學、研一體的綜合性研究應用體系。當然，為了應對更廣闊的市場需求，現階段無菌動物技術體系在制備技術、營養供給、設施設備研發等多方面仍需進一步完善，建立高效一體化應用體系，更好地服務于科學研究。