夏枯草顆粒對乳腺增生模型大鼠增生乳腺組織Bcl-2、Bax、PCNA 蛋白表達的影響

姚玲莉 王金秋 葉 丹 盛賢能 郭 宇

乳腺增生癥是女性常見的乳房疾病，發病率約為79.5%[1]。其本質是雌孕激素比例失調下的腺體增生與復舊不良。目前以藥物治療為主，如三苯氧胺、小金丸、乳癖消等。有研究發現，夏枯草顆粒對治療乳腺增生癥具有積極意義[2]。在超聲提示下，夏枯草顆粒可有效減小增生乳腺組織的腫塊直徑、導管直徑和腺體厚度[3]，達到較好的治療效果。但由于缺少夏枯草顆粒作用于乳腺增生組織的理論依據，未能廣泛應用于乳腺增生的治療。動物實驗研究提示，雌激素過度刺激背景下，乳腺組織增生與增殖細胞核抗原（PCNA）和B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）高表達相關[4-5]。本研究探討夏枯草顆粒在乳腺增生組織中的作用及作用機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 育齡期雌性SD 大鼠30 只，體質量180～220g，購自浙江維通利華責任有限公司，動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001。飼養于寧波大學動物實驗中心，動物使用許可證號：SYNK（浙）2019-0005。環境溫度20～25℃，相對濕度40%～60%，12h循環燈光，分籠飼養，自由進食飲水。本研究經倫理委員會審核，對動物處置方法符合相關倫理要求。

1.2 試 劑 苯甲酸雌二醇及黃體酮注射液購于購于吉林華牧有限公司（規格2mL：4mg，批號 200222；規格2mL：20mg，批號Z00302）；夏枯草顆粒購自山東仙河藥業有限公司（批號00860E2）。兔源性Bcl-2、Bcl-2 相關x 蛋白（Bax）、PCNA 單克隆抗體（江蘇親科生物有限公司，批號1109905、44q6915、64y1542）。

2 實驗方法

2.1 動物乳腺增生模型制備 30 只雌性育齡期SD大鼠，適應性喂養1 周后隨機數字表法分為正常對照組5 只，乳腺增生模型組25 只。乳腺增生模型組貫序肌注苯甲酸雌二醇0.5mg/kg 25 天及黃體酮4mg/kg 5 天[6]。同時，正常對照組肌注同體積生理鹽水連續30 天。

2.2 分組及給藥 將乳腺增生模型大鼠按隨機數字表法分為模型對照組、三苯氧胺組及夏枯草顆粒低、中、高劑量組，每組5 只。三苯氧胺組大鼠予三苯氧胺1.8mg/kg 溶液灌胃；夏枯草顆粒低、中、高劑量組大鼠分別予夏枯草顆粒0.5、1.0、3.0g/kg 溶液灌胃；正常對照組及模型對照組大鼠予同體積生理鹽水灌胃，每天1 次，連續28 天。

2.3 取材與制作石蠟切片 末次給藥1 周后，禁食24h，六組大鼠同時處死，并觀察乳房形態，取相同部位乳房（第四對左側乳房）組織，經乳頭向基底部最大切面取材。以4%多聚甲醛固定24h 后將乳腺組織修剪為0.5cm×0.5cm×0.5cm，放入至石蠟包埋，石蠟塊切片厚度4μm，制病理切片。使用蘇木精-伊紅（HE）染色法對石蠟切片進行染色，在光鏡下觀察乳腺組織病理變化。

2.4 卵白素-生物素-過氧化酶復合法（ABC 法）測定乳腺組織Bcl-2、Bax、PCNA 表達 將大鼠乳腺組織切片進行脫蠟補水，加熱、抗原修復，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，每次5min。3%H2O2去離子水孵育，阻斷內源過氧化酶活性。加血清封閉，加入一抗4℃下孵化過夜，PBS 沖洗3 次；加二抗，室溫孵育50min，PBS 沖洗3 次；滴加生物素化過氧化酶復合物，孵育30min，PBS 沖洗3 次。二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑顯色。流水沖洗、干燥、脫水、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察、獲取圖像、分析。

2.5 結果判斷（1）HE 染色：低倍鏡下計數每個小葉內腺泡數量，求出平均值。高倍鏡下觀察乳腺組織，計數增生體平均腺泡數量以及擴增導管數量。（2）免疫組化陽性細胞強度分析：用賽維爾圖像分析系統自動讀取組織測量區域，并分析計算出測量區域內弱中強陽性細胞數（陰性無著色，計0 分；弱陽性淡黃色，計1 分；中陽性棕黃色，計2 分；強陽性棕褐色計3分），總細胞數，陽性的累積光密度，陽性像素面積，組織面積。將每張切片內陽性數量及其染色強度轉化為相應的數值，計算組織化學評分（HS），數值越大說明綜合陽性強度越強。

2.6 統計學方法 應用SPSS24.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示。采用單因素方差分析，以LSD 法進行兩兩組間多重比較，應用Graphpad prism 8.0.2 制圖。以P<0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠乳腺組織病理學變化 低倍鏡下正常對照組平均小葉內腺泡數3～6 個，高倍鏡下乳腺導管上皮細胞排列規則，管腔無擴張，腔內未見分泌物及脫落細胞。模型對照組中，小葉腺泡數量明顯增加，多者達30 個，部分小葉被腺泡充滿，管腔擴張，腔內充滿分泌物并伴有少量脫落上皮細胞。導管上皮細胞增生且排列稍不規則，呈假復層或乳頭狀，同時核仁明顯。提示乳腺增生造模成功。低倍鏡下觀察，三苯氧胺組纖維組織增生明顯，小葉腺泡數5～10個，導管上皮細胞排列規則，未見明顯增生，管腔擴張，腔內見少許分泌物及脫落上皮細胞；夏枯草低劑量組纖維組織稍增生，小葉腺泡數量較多8～15 個，導管上皮細胞排列規則，未見明顯細胞增生，腔內見少許分泌物但未見明顯脫落上皮細胞；夏枯草中、高劑量組，乳腺導管上皮細胞排列規則，未見明顯細胞增生，部分接近正常對照組，部分仍可見管腔擴張，但管腔內分泌物較少，可見少量脫落上皮細胞。見圖1。

圖1 各組大鼠乳腺組織增生病理（HE ×400）

3.2 各組大鼠乳腺組織平均腺泡導管數及擴張導管數比較 與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織平均腺泡導管數及擴張導管數明顯增多（P 均<0.01）。與模型對照組比較，夏枯草低、中、高劑量組及三苯氧胺組大鼠乳腺組織腺泡導管數減少（P 均<0.05），并且三苯氧胺及高劑量組的平均腺泡導管數最接近正常對照組。見表1。

表1 各組大鼠乳腺組織平均腺泡導管數及擴張導管數比較（）

表1 各組大鼠乳腺組織平均腺泡導管數及擴張導管數比較（）

注：正常對照組未建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；模型對照組建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；三苯氧胺組建立乳腺增生模型，予三苯氧胺1.8mg/kg 灌胃4 周；夏枯草顆粒低、中、高劑量組，為建立乳腺增生模型后分別予夏枯草顆粒0.5、1.0、3.0g/kg 灌胃4周；與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05

3.3 各組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達HS 評分比較Bcl-2 陽性染色多位于細胞核內，并有細胞胞漿染色，大多切片中蛋白表達為彌漫表達。Bcl-2 蛋白表達在各組染色為黃棕色或棕色顆粒，肉眼所見差異并不顯著（見圖2）。六組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達HS 評分差異有統計學意義（F=2.431，P<0.05）。LSD法分析結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達差異無統計學意義（P=0.926）。與模型對照組比較，夏枯草高劑量組Bcl-2 表達明顯降低（P<0.05），夏枯草低、中劑量組及三苯氧胺組Bcl-2 表達呈降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 各組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達免疫組化圖（ABC 法×400）

3.4 各組大鼠乳腺組織Bax 表達HS 評分比較 Bax陽性染色主要為細胞胞漿染色，模型對照組大鼠乳腺組織Bax 蛋白表達染色為淺黃色，在三苯氧胺組以及夏枯草干預各組染色為棕黃色（見圖3），肉眼未見明顯差異。六組大鼠乳腺組織Bax 免疫組化HS 評分差異有統計學意義（F=3.125，P<0.05）。與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織Bax 表達降低（P<0.05）。與模型對照組比較，三苯氧胺組及夏枯草低、中、高劑量組大鼠乳腺組織Bax 呈降低趨勢，但各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 各組大鼠乳腺組織Bax 表達免疫組化圖（ABC 法×400）

3.5 各組大鼠乳腺組織PCNA 表達HS 評分比較PCNA 陽性染色主要位于細胞核，并有胞漿染色。PCNA 蛋白表達在模型對照組中為深棕色顆粒，正常對照組及夏枯草低劑量組染色稍淺，在三苯氧胺組、夏枯草中、高劑量組PCNA 蛋白僅為淡黃色（見圖4）。六組大鼠乳腺組織PNCA 蛋白免疫組化HS 評分統計分析結果顯示，差異有統計學意義（P<0.01）。與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織PCNA表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型對照組比較，三苯氧胺組及夏枯草低、中、高劑量組大鼠乳腺組織PCNA 表達明顯降低（P 均<0.05），且接近正常對照組。見表2。

圖4 各組大鼠乳腺組織PCNA 表達免疫組化圖（ABC 法×400）

表2 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、Bax、PCNA 表達HS 評分比較（分，）

表2 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、Bax、PCNA 表達HS 評分比較（分，）

注：正常對照組未建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；模型對照組建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；三苯氧胺組建立乳腺增生模型，予三苯氧胺1.8mg/kg 灌胃4 周；夏枯草顆粒低、中、高劑量組，為建立乳腺增生模型后分別予夏枯草顆粒0.5、1.0、3.0g/kg 灌胃4周；Bcl-2 為B 細胞淋巴瘤-2；Bax 為B 細胞淋巴瘤-2 相關X 蛋白；PCNA 為增殖細胞核抗原；HS 為組織化學評分；與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05

4 討論

乳腺增生癥在病理學上表現為乳腺腺泡和導管局灶性增生，并伴有間質纖維組織進行性增生，小葉失去正常形態，分為一般性增生和非典型增生[7]。PCNA 與Bcl-2 蛋白高表達被認為與乳腺腺體增生有關。PCNA 作為修復與DNA 復制的組成部分，參與細胞S 周期控制、細胞凋亡[8]。在單純性增生中可見PCNA 陽性細胞，增殖指數和PCNA 的陽性程度與非典型上皮增生的增殖程度呈正相關[9]。Bcl-2 與Bax 為Bcl-2 基因家族成員，兩者共同調控細胞凋亡。在細胞中Bcl-2 同源性區域3（BH3）蛋白通過抑制線粒體和內質網中的抗凋亡蛋白傳播細胞凋亡信號，或直接刺激Bax 等促凋亡蛋白表達，導致Bax 寡聚導致線粒體外膜透化，最終誘導細胞凋亡，Bcl-2則可與BH3 基序結合隔離促凋亡蛋白Bax，抑制凋亡[10]。當Bcl-2 過表達，促凋亡與抗凋亡蛋白平衡被打破，則使細胞存活增殖。

夏枯草顆粒具有免疫調節[11]、抗炎[12]、抗腫瘤[13]等多種藥理作用。本研究結果顯示，與模型對照組比較，使用夏枯草藥物干預組，乳腺平均腺泡導管數與擴張導管數明顯減少，更接近正常乳腺組織結構。

本研究還顯示，模型對照組中大鼠乳腺導管上皮細胞中PCNA 表達明顯增高，采用夏枯草顆粒治療組后，PCNA 表達則明顯下降。提示PCNA 與乳腺增生相關，夏枯草顆粒通過抑制PCNA 表達發揮作用。近年研究提出，抑制PCNA 的酪氨酸211 磷酸化則可減少PCNA 表達，實現抑制細胞增殖的結果[14]，但是否為夏枯草抑制PCNA 的機制，仍需進一步研究。正常對照組乳腺組織中Bax 表達明顯高于模型對照組，這一結果提示，Bax/Bcl-2 極有可能參與乳腺增生，在增生乳腺組織中Bcl-2 過表達抑制Bax表達。在熊燚等[15]的研究，夏枯草發揮抗甲狀腺腫瘤的作用與Bax/Bcl-2 蛋白表達有關，夏枯草處理組Bcl-2 蛋白表達水平減少（P<0.05）；凋亡蛋白Bax 表達有增加趨勢，但差異無統計學意義。本研究發現，高劑量組與模型對照組比較，Bcl-2 明顯減少（P＜0.05），與以往此類研究基本相一致。

綜上所述，夏枯草顆粒可通過降低PCNA 表達，下調Bcl-2 及促進Bax 表達來改善大鼠乳腺增生。