miR-100 過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)AMPK-mTOR-p70S6K 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬發(fā)揮抗膿毒癥作用的研究

王艷鵬 黃世恩 陳志明

膿毒癥是一種由于感染引起的組織損傷性疾病，作為重癥監(jiān)護(hù)室的主要致死因素之一，其死亡率高達(dá)30%～50%[1]。膿毒癥所引起的心肌損傷以及心臟功能障礙是高死亡率的主要原因。目前認(rèn)為，膿毒癥的發(fā)病首先激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，天然免疫細(xì)胞分泌大量的炎癥因子，組成炎癥免疫的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而引起包括心臟在內(nèi)的多器官損傷[2-3]。膿毒癥的發(fā)生是一個(gè)促炎和抗炎共同作用的結(jié)果，典型的膿毒癥發(fā)病過(guò)程首先是促炎作用占據(jù)主導(dǎo)，多種免疫細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)來(lái)激活機(jī)體的抗感染能力，同時(shí)還可激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的免疫強(qiáng)度[4-5]。因此，有效抑制機(jī)體的“炎癥風(fēng)暴”，是治療膿毒癥及控制膿毒癥器官損傷的重要手段。microRNA 是體內(nèi)一類(lèi)非編碼小RNA，通過(guò)與mRNA 的3'UTR 配對(duì)，抑制靶基因翻譯或降解靶基因[6]。單一的microRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因，同一個(gè)基因也可同時(shí)受控于多個(gè)microRNA，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-100是microRNA 中的重要成員。有研究指出，miR-100可以通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)的自噬水平，從而發(fā)揮抑制血管炎癥反應(yīng)的作用[7]。本研究通過(guò)構(gòu)建體外膿毒癥心肌細(xì)胞模型，研究miR-100 在膿毒癥中的作用，并進(jìn)一步探究其發(fā)揮作用的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 脂多糖（LPS）購(gòu)買(mǎi)自上海Sigma 公司（批號(hào)SMB00704）；ELISA 試劑盒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司[白介素-1β（IL-1β）：批號(hào)BMS630TEN，白介素-6（IL-6）：批號(hào)ERA31RBX5，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）：批號(hào)ERA56RBX5）；TRIzol試劑購(gòu)買(mǎi)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)15596026）；miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）試劑盒購(gòu)買(mǎi)自生工生物工程（上海）有限公司（批號(hào)B532453）；p62（批號(hào)PA5-115712），LC3（批號(hào)PA1-16931），beclin-1（批號(hào)PA1-16857），AMPK（批號(hào)MA5-15815），p-AMPK（批號(hào)PA5-104982），mTOR（批號(hào)PA5-34663），p-mTOR（批號(hào)PA5-104898），p70S6K（批號(hào)PA1-31167）和p-p70S6K（批號(hào)MA5-15202）抗體購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Invitrogen 公司。熒光顯微鏡（日本尼康Nikon 公司）；PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 心肌細(xì)胞H9C2 來(lái)自美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。使用 DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在5% CO2、37℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9C2。1μg/mL LPS 刺激心肌細(xì)胞H9C2 24h 構(gòu)建膿毒癥體外細(xì)胞模型[8]。細(xì)胞分為以下四組：對(duì)照組、LPS 組、LPS+miR-100 激動(dòng)劑組和LPS+miR-100 拮抗劑組。將正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為對(duì)照組，LPS 刺激的心肌細(xì)胞作為L(zhǎng)PS 組，LPS+miR-100 激動(dòng)劑組為在H9C2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-100激動(dòng)劑并用LPS 造模，LPS+miR-100 拮抗劑組為在H9C2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-100 拮抗劑并用LPS 造模。

1.3 miR-100 水平檢測(cè) 使用TRIzol 試劑從心肌細(xì)胞H9C2 中提取總RNA（含miRNA）。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的純度和濃度。使用miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR。miR-100定量PCR 的正向引物（5'→3'）序列為GCGAACCCGTAGATCCGAA，反向引物（5'→3'）序列為AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，U6 為內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-100 相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 炎癥因子水平檢測(cè) 收集心肌細(xì)胞H9C2 培養(yǎng)液上清，用于檢測(cè)IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，使用ELISA 試劑盒測(cè)量培養(yǎng)液上清中的炎癥因子表達(dá)。

1.5 自噬相關(guān)蛋白LC3 的細(xì)胞免疫熒光 心肌細(xì)胞H9C2 首先用4%多聚甲醛固定，再用0.5%Triton-X 滲透，LC3 抗體在4℃孵育過(guò)夜后進(jìn)行熒光二抗孵育，隨后DAPI 染色。最后，在熒光顯微鏡下采集并分析熒光圖像。

1.6 自噬相關(guān)蛋白和AMPK-mTOR-p70S6K 通路相關(guān)蛋白水平檢測(cè) 細(xì)胞裂解液裂解心肌細(xì)胞H9C2后，低溫高速離心獲得蛋白上清。通過(guò)10% SDSPAGE 分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。首先用5%脫脂奶粉孵育膜，再用自噬相關(guān)蛋白（p62、LC3 和beclin-1）和AMPK-mTOR-p70S6K 通路相關(guān)蛋白（AMPK、p-AMPK、mTOR、p -mTOR、p70S6K 和p -p70S6K）的一抗低溫過(guò)夜孵育。次日，二抗室溫孵育1h。最后，使用BioRad 成像系統(tǒng)對(duì)印跡進(jìn)行成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件分析兩組之間的差異，采用t-test 檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。P<0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 miR-100 在膿毒癥心肌細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)qRT-PCR 結(jié)果表明，miR-100 在膿毒癥心肌細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，本研究為了研究miR-100 在膿毒癥中的作用，在H9C2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-100 激動(dòng)劑或miR-100 拮抗劑并用LPS 造模，使得膿毒癥心肌細(xì)胞miR-100 過(guò)表達(dá)或表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)表1）。

表1 miR-100 水平變化（）

表1 miR-100 水平變化（）

注：對(duì)照組為正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞H9C2；LPS 組為H9C2 用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+miR-100 激動(dòng)劑組為在H9C2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-100 激動(dòng)劑并用LPS 造模；LPS+miR-100 拮抗劑組為在H9C2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-100 拮抗劑并用LPS 造模；LPS 為脂多糖；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LPS 組比較，bP<0.05；與LPS+miR-100 激動(dòng)劑組比較，cP<0.05

2.2 miR-100 對(duì)膿毒癥心肌細(xì)胞的炎癥因子水平的影響 ELISA 檢測(cè)炎癥因子水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，LPS 組炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著增加，膿毒癥體外細(xì)胞模型構(gòu)建成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與LPS 組比較，LPS+miR-100 激動(dòng)劑組上調(diào)miR-100 表達(dá)，炎癥因子分泌量降低；LPS+miR-100拮抗劑組敲低miR-100 水平可促進(jìn)炎癥因子分泌。見(jiàn)表2。

表2 miR-100 對(duì)IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平影響（pg/mL，）

表2 miR-100 對(duì)IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平影響（pg/mL，）

注：對(duì)照組為正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞H9C2；LPS 組為H9C2 用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+miR-100 激動(dòng)劑組為在H9C2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-100 激動(dòng)劑并用LPS 造模；LPS+miR-100 拮抗劑組為在H9C2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-100 拮抗劑并用LPS 造模；LPS 為脂多糖；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白細(xì)胞介素-6；IL-1β 為白細(xì)胞介素-1β；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LPS 組比較，bP<0.05；與LPS+miR-100 激動(dòng)劑組比較，cP<0.05

2.3 miR-100 對(duì)膿毒癥心肌細(xì)胞自噬的影響 免疫熒光結(jié)果表明，與LPS 組比較，LPS+miR-100 激動(dòng)劑組miR-100 過(guò)表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)LC3 表達(dá)明顯增加；反之，敲低miR-100，LPS+miR-100 拮抗劑組LC3 表達(dá)降低（見(jiàn)圖1）。Western blot 結(jié)果顯示，在LPS+miR-100 激動(dòng)劑組LC3-Ⅰ/Ⅱ、beclin-1 表達(dá)上調(diào)，而自噬負(fù)調(diào)控蛋白p62 表達(dá)降低；LPS+miR-100 拮抗劑組LC3-II 及beclin-1 蛋白表達(dá)降低，而p62 表達(dá)升高，見(jiàn)圖2。

圖1 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)LC3 蛋白（×200）

圖2 Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 miR-100 影響AMPK-mTOR-p70S6K 通路相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot 檢測(cè)AMPK-mTOR-p70S6K信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，與LPS 組比較，LPS+miR-100 激動(dòng)劑組上調(diào)miR-100 的表達(dá)，使得p-AMPK 表達(dá)上調(diào)，p-mTOR 和p-p70S6K 表達(dá)下調(diào)；LPS+miR-100 拮抗劑組下調(diào)miR-100 的表達(dá)，引起了相反的變化，見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot 檢測(cè)AMPK-mTOR-p70S6K 信號(hào)通路相關(guān)蛋白

3 討論

自噬是機(jī)體重要的細(xì)胞代謝通路，一些受損細(xì)胞器及折疊錯(cuò)誤的蛋白通過(guò)自噬途徑降解后被細(xì)胞循環(huán)利用[8]。目前認(rèn)為，自噬在多種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[9]。研究表明，自噬在多種炎癥、免疫相關(guān)性疾病中發(fā)揮抗炎作用，包括炎癥性腸病、心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死等[10-14]。在膿毒癥中，已有報(bào)道指出，上調(diào)自噬水平，尤其是巨噬細(xì)胞等炎癥免疫細(xì)胞，可以降低膿毒癥動(dòng)物模型的死亡率，發(fā)揮心臟等多器官保護(hù)作用[15]。另有報(bào)道指出，上調(diào)自噬水平可以通過(guò)抗炎作用減輕膿毒癥引起的心肌損傷[16]。

已有研究表明，miR-100 在細(xì)胞中能夠調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)而影響多種疾病發(fā)展，如結(jié)直腸癌、腎癌、肝細(xì)胞癌、慢性血管炎癥等[7，17-19]。miR-100 在腎細(xì)胞癌中增強(qiáng)自噬并抑制了細(xì)胞遷移和侵襲[18]。并且，miR-100 能夠通過(guò)抑制mTOR 和IGF-1R 表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的自噬[19]。本研究利用LPS（1μg/mL）刺激大鼠心肌細(xì)胞H9C2，構(gòu)建了膿毒癥體外細(xì)胞模型。ELISA檢測(cè)炎癥因子水平，發(fā)現(xiàn)LPS 刺激后，炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著增加，表明膿毒癥體外細(xì)胞模型構(gòu)建成功。LPS 處理心肌細(xì)胞H9C2后，qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)miR-100 表達(dá)下調(diào)。然而，通過(guò)在膿毒癥心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-100，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)，同時(shí)炎癥因子表達(dá)下調(diào)，促炎作用減弱，抗炎作用增強(qiáng)；反之，下調(diào)miR-100 表達(dá)，心肌細(xì)胞自噬水平減弱，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞使miR-100 表達(dá)下調(diào)，炎癥反應(yīng)增加；過(guò)表達(dá)miR-100 能夠上調(diào)自噬，減弱炎癥反應(yīng)，考慮miR-100 是多因素多通路調(diào)控自噬中的一個(gè)環(huán)節(jié)，自噬作為保護(hù)性機(jī)制發(fā)揮抗膿毒癥作用。

已知AMPK-mTOR-p70S6K 為經(jīng)典的自噬相關(guān)信號(hào)通路[20]。同時(shí)，與此信號(hào)通路相關(guān)的自噬在多種炎癥相關(guān)性疾病中發(fā)揮了抗炎作用[21-22]。Western blot發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-100 的表達(dá)，使得通路中p-AMPK表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致p-mTOR 和p-p70S6K 表達(dá)下調(diào)；下調(diào)miR-100 的表達(dá)則引起相反的變化，進(jìn)而引起相關(guān)自噬蛋白表達(dá)變化，影響細(xì)胞自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或下調(diào)miR-100 的表達(dá)能夠引起AMPKmTOR-p70S6K 通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生相應(yīng)的變化，明確了過(guò)表達(dá)miR-100 可以通過(guò)上調(diào)AMPKmTOR-p70S6K 介導(dǎo)的自噬水平，進(jìn)而在膿毒癥中發(fā)揮保護(hù)作用。