基于網絡藥理學策略探討四君子湯治療癌性惡病質的潛在機制

陳江鋒 林芝嫻 郭 勇

癌性惡病質被國際共識小組定義為一種多因素綜合征，其特征是骨骼肌質量持續下降（伴或不伴脂肪減少），不能通過常規營養支持完全逆轉，導致進行性損害[1]。50%～80%的癌癥患者最終會發展為惡病質，進一步加速了癌癥患者的死亡。因此，癌性惡病質的治療一直是惡性腫瘤綜合治療中的重要組成部分。四君子湯被廣泛應用于治療癌性惡病質，其對疲勞、食欲不振、體重減輕等癥狀有較好的療效[2-3]。研究發現，四君子湯可以顯著降低血清中白細胞介素-1（interleukin 1，IL-1）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）的水平，減緩癌性惡病質骨骼肌萎縮的發生，改善癌性惡病質患者的營養狀況，延緩疾病的進一步發展[4-6]。然而目前四君子湯對癌性惡病質的具體作用機制尚不清楚，鑒于中醫治療的整體觀念和中藥方劑多化合物、多靶點、多通路協同作用的特點，本研究采用四個連續模塊（靶點預測、網絡構建、分子對接、GO 和KEGG 富集分析）組成的綜合網絡藥理學方法探討四君子湯治療癌性惡病質的潛在機制。

1 方 法

1.1 靶點預測

1.1.1 四君子湯的化合物 查詢中藥系統藥理學數據庫（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中醫藥綜合數據庫（TCMID，http://bidd.group/group2017/index.html），參照TCMSP 數據庫中常用的標準：口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，Caco-2≥0，通過Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索每個活性化合物的化學結構，剔除沒有結構信息的化合物。最終共搜索到105 個活性化合物。

1.1.2 四君子湯的復合靶點 Pharmmapper server（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）是一個持續更新的綜合藥效基因匹配平臺。將105 種化合物的mol2 格式文件上傳至Pharmmapper server，generate confomers 設置為No，maximum generated conformations 設置為300。在高級選項中，選擇Druggable Pharmacophore Models（v2017，16159）作為靶點集，其他選項設置為默認，獲得預測的靶點。將搜索到的靶點導入UniProt 數據庫（http://stitch.embl.de），選擇的物種為Homo sapiens，去除重復、非人、非標靶，通過檢索和轉化，最終得到四君子湯中活性化合物的450 個靶基因。

1.1.3 癌性惡病質的靶點 通過DrugBank database（https://www.drugbank.ca），Online Mendelian Inheritance in Man database（OMIM，https://omim.org），Human gene database（GeneCards，https://www.genecards.org）和Therapeutic Target Database（TTD，https://db.idrblab.org/ttd/）搜集癌性惡病質的相關靶點。以“Cancer cachexia”為關鍵詞進行搜索，刪除重復靶點，最終搜集到1189 個靶點。

1.1.4 蛋白相互作用網絡構建 用Venny 2.1 軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將四君子湯的活性化合物靶點與癌性惡病質相關靶點進行匹配，選擇重疊靶點作為四君子湯治療癌性惡病質的靶點，使用String（https://string-db.org/）對相關靶點進行處理，蛋白類型設置為Homo sapiens，minimum required interaction score 設置為“medium confidence”（>0.4），其他參數設置為默認，獲得最終的蛋白相互作用網絡。

1.2 網絡構建

1.2.1 網絡構建的方法 Cytoscape 是一個開放性平臺，用于可視化復雜網絡并能將其與任何屬性的數據進行處理。將化合物和蛋白相互作用網絡的數據輸入到Cytoscape 中，并構建不同的網絡:復合靶點網絡和化合物-靶點網絡。

1.2.2 拓撲分析 通過拓撲參數分析，對復合靶點網絡進行分析篩選。通過度中心性（degree centrality，DC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、介度中心性（betweeness centrality，BC）三個參數對重要靶點進行評價。這三個參數的大小代表了網絡中節點的重要性。重要節點表示網絡中輸出值高。篩選標準為DC、CC、BC 大于1 倍中位數。最后，篩選出重要靶點。

1.3 分子對接 通過分子對接驗證四君子湯中化合物與重要靶點的結合活性，篩選出潛在的活性成分。我們之前搜集到的105 個化合物的小分子結構都是從Pubchem 數據庫中獲取的，并保存為mol2 格式文件。所有具有重要靶點蛋白晶體結構的蛋白配體均從RCSB 蛋白數據庫（https://www.rcsb.org/）中獲得。SystemsDock（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）是一個基于網絡藥物學預測和分析的網絡服務器，使用高精度的對接模擬和分子通路圖來充分表達配體的選擇性，揭示配體在復雜分子網絡中的作用。因此，我們將這兩種數據導入SystemsDock 中進行分子對接，并以對接得分作為評價標準。

1.4 GO 和KEGG 富集分析 將用于治療癌性惡病質的四君子湯的相關靶點導入到DAVID 數據庫中（DAVID，http://david.abcc.ncifcrf.gov/）。所有的靶基因都被導入到基因列表中，物種被定義為人類。通過上述數據庫檢索和轉換，進行GO 生物過程和KEGG代謝通路富集分析。P<0.05 為顯著的生物過程。使用在線作圖網站Omishare Tools（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）將結果可視化。

2 結果

2.1 靶點預測 經過篩選和刪除，在TCMSP 和TCMID 數據庫中搜集到105 個四君子湯的化合物。其中黨參16 個，白術2 個，茯苓13 個，甘草74 個。通過Pharmmapper server 對105 個化合物的靶點進行搜索，經UniProt 數據庫處理后得到450 個潛在化合物靶點。通過檢索DrugBank、OMIM、GeneCards 和TTD 數據庫，共獲得1189 個癌性惡病質的相關靶點。最后，通過Venny 2.1 軟件獲得藥物化合物與疾病的52 個交集靶點（見圖1）。

圖1 四君子湯作用靶點和疾病靶點的Venny 圖

2.2 網絡構建 將蛋白相互作用網絡的數據導入Cytoscape 軟件，以確定靶蛋白之間的相互作用網絡。圖中的節點表示靶蛋白，邊表示靶蛋白之間的相關性。剔除相關性較低的節點，包括50 個節點和140條邊。拓撲分析的主要參數為度、接近中心性和介度中心性。初次篩選度為3.5，介度中心性為0.007233，接近中心性為0.404986，得到17 個節點、54 條邊。第二次篩選度是6，介度中心性為0.030593，接近中心性為0.445491，最后得到了8 個節點和25 條邊（見圖2）。在蛋白相互作用網絡中，根據度的大小，INS（25），ALB（25），VEGFA（16），CCND1（15），CTNNB1（14），CYCS（13），AR（12）和ACTA1（8）被認為是重要的靶點（見圖3）。以這8 個重要靶點為基礎，構建化合物-重要靶點網絡（見圖4），這個網絡包括96 種化合物，其中ZINC00519174（PubChem CID：928837）、Gancaonin H（PubChem CID：5481949）、Frutinone A（PubChem CID：441965）和DFV（Pub－Chem CID：114829）與5 個重要靶點均相關。

圖2 蛋白相互作用網絡的拓撲篩選

圖3 四君子湯治療癌性惡病質的潛在靶點相互作用網絡

圖4 化合物-重要靶點網絡

2.3 分子對接

2.3.1 結合活性驗證 選取8 個重要靶點（INS、ALB、VEGFA、CCND1、CTNNB1、CYCS、AR 和 ACTA1），導入SystemsDock，與105 個四君子湯的化合物進行對接分析。超過7.0 分的化合物有168 個（20%），5.0～7.0 分的化合物有502 個（59.8%），4.25～5.0 分的化合物有68 個（8.1%）。共有102 種化合物（12.1%）的對接分數小于4.25。對接分數大于7.0 說明該化合物對靶點具有較強的結合活性，大于5.0 說明該化合物對靶點具有較好的結合活性，大于4.25說明該化合物對靶點具有一定的結合活性。因此，四君子湯的活性化合物與8 個重要靶點具有良好的結合活性。

2.3.2 核心化合物的篩選 對接結果表明，與8 個靶點對接得分最高的化合物為ergosterol peroxide（PubChem CID：5351516，和CYCS），glyasperin B（PubChem CID：480784，和VEGFA），dehydroeburicoic acid（PubChem CID：15250826，和 ALB），glyasperin F（PubChem CID：392442，和INS），ergosterol peroxide（PubChem CID：5351516，和AR），taraxerol（PubChem CID：92097，和ACTA1），7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717，和CCND1）和 5' -prenylbutein（PubChem CID：11267805，和CTNNB1）。使用PyMOL 軟件對這8 對靶點化合物進行優化，對接的特異性蛋白配體相互作用如圖5 所示。8 個靶點得分均在6 分以上的化合物為7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717），taraxerol（PubChem CID：92097），Cerevisterol（PubChem CID：10181133），hederagenin（Pub-Chem CID：73299），polyporenic acid C（PubChem CID：9805290），16 alpha-hydroxydehydrotrametenolic acid（PubChem CID：10743008），pachymic acid（Pub-Chem CID：5484385）和poricoic acid C（PubChem CID：56668247）。滿足上述兩個條件的化合物[7，9（11）-dehydropachymic acid 和taraxerol]被認為是可能通過作用于重要靶點而影響癌性惡病質的核心化合物。

圖5 蛋白質-配體的對接模擬

2.4 GO 和KEGG 富集分析

2.4.1 GO 富集分析 用DAVID 工具對四君子湯治療癌性惡病質的52 個靶點進行GO 富集分析，進一步明確交集靶點的可能作用。生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞組分（cellular component）的比對條目見圖6。

圖6 四君子湯治療癌性惡病質潛在靶點的生物學功能分析

2.4.2 KEGG 通路富集分析 通過KEGG 通路富集分析篩選出四君子湯對癌性惡病質中36 條生物通路有顯著影響（見表1）。其作用機制主要涉及pathways in cancer，HTLV-I infection，viral carcinogenesis，human cytomegalovirus infection，PI3K-Akt signaling pathway，human papillomavirus infection 和thyroid hormone synthesis 等（見圖7）。對36 條信號通路進行分析和整合，繪制出最終的通路圖（見圖8）。

表1 四君子湯靶點的通路分析

圖7 四君子湯治療癌性惡病質的KEGG 富集關鍵靶點氣泡圖

圖8 四君子湯治療癌性惡病質的潛在機制

3 討論

在臨床實踐中，四君子湯對癌性惡病質的治療有顯著作用，可以減輕化療引起的毒性或肌肉萎縮[5，7-9]。本文從網絡藥理學的角度探討了四君子湯治療癌性惡病質的潛在機制。

3.1 調節代謝 惡性腫瘤可通過自身代謝產生的有毒物質或通過改變機體代謝而引起惡病質，主要表現為葡萄糖代謝，脂質代謝和蛋白質代謝三個方面的異常。四君子湯通過其化合物如glycitein（Pub－Chem CID：5317750），isorhamnetin（PubChem CID：5281654），quercetin（PubChem CID：5280343），11-hydroxyrankinidine（PubChem CID：5318332）和AC1LCTJ1（PubChem CID：637112），可刺激INS 與其受體結合，調控PI3K-Akt 信號通路，上調Akt2 的表達，影響下游靶點，抑制PCK2 的表達，最終抑制胰島素抵抗[10-11]，調節糖代謝，抑制癌性惡病質的發展。在四君子湯中，影響FABP3 的活性成分包括5 alpha-stigmastan-3，6-dione（PubChem CID：13992092），Ergosta -7，22 e -dien -3beta -ol（PubChem CID：5283628），poricoic acid C（PubChem CID：56668247），glyasperin C（PubChem CID：480859），gancaonin A（PubChem CID：5317478），和licocoumarone（Pub－Chem CID：503731），這些活性成分通過影響FABP3來調控PPAR 信號通路，進而下調下游靶基因轉錄表達水平，抑制脂質分解和脂肪酸氧化，從而降低機體能量消耗[12]。此外，四君子湯中的Taraxerol（Pub－Chem CID：92097）、perlolyrine（PubChem CID：160179）、Stigmasterol（PubChem CID：5280794）等成分可能通過調控mTOR 下游信號通路磷酸化4EBP1，增加eIF4E 和eIF4G 的結合活性，最終促進骨骼肌蛋白合成[13]。化合物如11-hydroxyrankinidine（PubChem CID：5318332）和AC1LCTJ1（PubChem CID：637112）作用于INS，Quercetin 作用于SKP1，進一步調控PI3K/Akt/mTOR 通路[14]，從而抑制蛋白分解。

3.2 抑制腫瘤 惡性腫瘤可通過促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤血管生成等途徑導致癌性惡病質的發生發展。四君子湯的活性成分licochalcone B（PubChem CID：5318999）、isorhamnetin（PubChem CID：5281654）、calycosin（PubChem CID：5280448）等可能通過影響Wnt 和JAK-STAT 信號通路，抑制CCND1、CTNNB1、STAT5A 的表達[15-17]，調控細胞周期，抑制細胞增殖，發揮其抗腫瘤作用。7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717）、poriferasta-7，22 e-dien-3beta-ol（Pub-Chem CID：5283663）、luteolin（PubChem CID：5280445）等活性成分可能作用于IL6ST 和AR[18-19]，調節信號轉導，最終抑制腫瘤細胞增殖。在四君子湯中，licochalcone B（PubChem CID：5318999）作 用 于STAT5A 和CYCS[20-22]，抑制JAK-STAT 等信號通路下游表達，促進腫瘤細胞凋亡。licochalcone B（Pub－Chem CID：5318999）對STAT5A 和CYCS 的調控可能是四君子湯對腫瘤細胞凋亡調控的關鍵部分。此外，四君子湯可能通過calycosin（PubChem CID：5280448）作用于VEGFA，調控PI3K-Akt、HIF-1、VEGF 信號通路下游基因的表達，最終抑制腫瘤血管生成[23-24]。

4 結論

運用網絡藥理學和分子對接方法預測四君子湯治療癌性惡病質的化合物、靶點和通路。其潛在機制可能主要集中在調節代謝和抑制腫瘤兩個方面，調節代謝包括調節葡萄糖、脂質和蛋白質的代謝，抑制腫瘤包括防止細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，抑制血管生成。特異性信號通路分析表明，四君子湯主要通過PI3K-Akt 和Wnt 信號通路發揮治療癌性惡病質的作用。因此，四君子湯通過多個化合物、多個靶點、多個通路的直接或間接協同作用，能夠有效地對抗癌性惡病質。然而，本研究僅是基于數據分析，尚需要進一步的體內和體外實驗來驗證。