一例骨骼發育異常胎兒ALPL 基因的遺傳學分析

唐克峰 李 志 夏莉花 舒 艷 胡 剛 方 嶸 沈國松

低磷酸酯酶癥（hypophosphatasia，HPP）是一種由于編碼組織非特異性堿性磷酸酶（tissue non-specific alkaline phosphatase，TNSALP）的堿性磷酸酯酶基因（alkaline phosphatase gene，ALPL）變異導致的罕見常染色體顯性或隱性遺傳病，臨床表現主要是骨骼和牙齒礦化不全以及血清堿性磷酸酶（ALP）活性偏低[1]。重癥HPP 的發病率大概為十萬分之一，輕度HPP 較多見，血清ALP 活性和分子遺傳學是最常用的診斷方法，目前尚無可靠的治療方法[2]。本研究中，我們對1 例骨骼發育異常胎兒的染色體核型、全基因組拷貝數變異以及骨骼系統相關基因的致病性變異進行分析，為其產前診斷提供分子遺傳學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，24 歲，停經19+2W，唐氏篩查高風險（1/180），產前診斷超聲（超聲儀器是GE，volusionE8，超聲頻率3.5～5MHz，檢查方法：超聲探頭尋找胎兒上肢，顯示完整肱骨，盡量讓聲束與肱骨垂直，正常肱骨是平直的，成角的肱骨顯示肱骨分成兩條有角度的強回聲。股骨也是同樣的方法顯示。）顯示股骨及肱骨彎曲成角（見圖1）。余無殊。夫妻否認近親結婚，家族中無類似病史。所有研究對象均已簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準（2019-R-016）。

圖1 胎兒產前診斷超聲圖（A：胎兒左肱骨成角；B：胎兒右肱骨成角；C：胎兒左股骨成角；D：胎兒右股骨成角）

1.2 方 法

1.2.1 常規染色體核型分析 無菌條件超聲引導下經腹壁行羊膜腔穿刺術，抽取羊水細胞30mL，并對羊水細胞進行培養、制片、G 顯帶核型分析。

1.2.2 染色體微陣列分析技術（chromosomal microarray analysis，CMA）檢測 利用Affymetrix Cytoscan 750k 芯片（CYTOSCAN 750K ARRAR AND R p/n 901859）檢測羊水細胞全基因組不平衡現象。

1.2.3 應用DNA 提取試劑盒（廈門至善生物公司，批號200517）提取胎兒、孕婦及其丈夫外周血的基因組DNA，利用紫外分光光度計測量待檢DNA 濃度及純度，取一定量的DNA 原液稀釋成20ng/μL 的工作濃度，-20℃保存備用，DNA 原液-70℃保存。使用Aligent SureSelect 方法制備檢測樣本。文庫采用Illumina HiSeq X-Ten 系統完成高通量測序。利用FastQC、BWA（v0.7.15-r1140）、Picard、GATK（v3.7-0）、Annovar 及VEP 等軟件包進行生物信息學分析。結合人群基因變異數據庫（dbSNP 數據庫（SNP150）、千人基因組數據庫等）信息，去除MAF＞0.01 或MAF＞0.05 的高頻變異。參考美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關指南[3]，并篩選出與先證者表型相關的可疑致病性變異。針對篩選出的可疑致病基因變異，利用Primer 3 軟件設計PCR 引物進行擴增及Sanger 測序分析。采用Mutation Surveyor等軟件對測序數據進行分析。孕婦及其丈夫、胎兒DNA 樣本測序結果進行家系共分離分析。

2 結果

2.1 常規染色體檢型分析結果 胎兒羊水染色體核型分析結果為46，XN。

2.2 CMA 檢測結果 未發現致病性拷貝數變異、雜合性缺失及單親二倍體。

2.3 基因檢測結果 提示胎兒ALPL 基因存在第2外顯子c.18del 和第9 外顯子c.979T＞C 復合雜合變異（見圖2）。其中c.18del 為移碼變異，屬于功能缺失性變異，功能預測軟件結果偏向于致病性變異，根據ACMG 指南[3]分析該變異致病性為P（致病性變異）=PM2（ESP 數據庫、千人數據庫、EXAC 數據庫中正常對照人群中未發現的變異）+PM3（在隱性遺傳病中，在反式位置上檢測到致病變異）+PVS1（當一個疾病的致病機制為功能喪失時，無功能變異）。c.979T＞C為錯義變異，功能預測軟件結果偏向于致病性變異，預測值為0.991。根據ACMG 指南[3]分析該變異致病性為P（致病性變異）=PM2（ESP 數據庫、千人數據庫、EXAC 數據庫中正常對照人群中未發現的變異）+PM3（在隱性遺傳病中，在反式位置上檢測到致病變異）+PS3（體內、體外功能實驗已明確會導致基因功能受損的變異）+PP3（多種統計方法預測出該變異會對基因或基因產物造成有害的影響，包括保守性預測、進化預測、剪接位點影響等）。ALPL 基因轉錄本為NM_000478.4。

圖2 堿性磷酸酯酶基因Sanger 測序示意圖

2.4 孕婦夫婦相關基因驗證結果 孕婦為c.18del雜合變異攜帶者，其丈夫為c.979T>C 雜合變異攜帶者（見圖2）。

3 討論

HPP 是一種罕見遺傳性代謝性骨病，不同的基因變異位點對于酶的生物學功能影響程度不一導致臨床表現多種多樣[4]。根據患者最早出現癥狀的年齡和嚴重程度將HPP 分為圍產期致死型、圍產期良性型、嬰幼兒型、兒童型、成人型和牙齒型，鑒于目前沒有根治方法，該病的遺傳咨詢和產前診斷顯得尤為重要。其中圍產期致死型表現出嚴重的骨骼礦化障礙，胎兒存在發育遲緩、骨骼成角等骨骼畸形，通常導致死胎或新生兒死亡[5]。

ALPL 是HPP 的致病基因，位于染色體1p36.1，包含12 個外顯子，編碼524 個氨基酸，在基因組中跨度約50kb，其mRNA 長度為2580bp，開放讀框ORF 長度為1575bp。截至2020 年5 月29 日，國際上建立的低磷酸酯酶癥基因變異數據庫（http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php）已報道了410 個ALPL 基因變異，變異類型絕大部分為錯義變異共292 種（占71.2%），缺失變異有45 種（占11.0%），其它還包括剪切變異、插入變異、無義變異等多種變異類型，變異分布于ALPL 基因各編碼區，在外顯子5區域發生變異頻率最高。Mornet[6]研究發現HPP 患者ALPL 基因變異中9 號外顯子變異相對較多，提示可能存在種族差異。95%的HPP 可檢測到ALPL 基因變異，即使未檢測到ALPL 基因變異，也有可能變異位于內含子區或調節區，當然也可能存在新的致病基因[7]。ALPL 基因編碼的TNSALP 是一種廣泛存在于各類組織的磷酸單酯酶，在骨骼礦化作用中表現為催化和水解焦磷酸并產生羥磷灰石結晶需要的磷，該酶活性降低可以引起無機焦磷酸酶鹽等多種底物蓄積，從而引起骨軟化或者佝僂病[8]。

本研究中對1 例胎兒超聲發現骨骼成角異常的孕婦進行侵入性產前診斷，其中羊水細胞染色體核型為46，XN，羊水細胞CMA 檢測未發現致病性拷貝數變異、雜合性缺失及單親二倍體。骨骼系統相關基因檢測提示胎兒ALPL 基因存在第2 外顯子c.18del和第9 外顯子c.979T＞C 復合雜合變異。其中c.18del為移碼變異，屬于功能缺失性變異，該變異導致ALPL 基因編碼的第7 位氨基酸纈氨酸變成酪氨酸，且繼續編碼12 個氨基酸后終止翻譯，產生的截斷蛋白喪失了發揮酶活性及骨骼礦化作用至關重要的區域。該變異十分罕見，僅有劉海娟等[9]報道了1 例兒童型低磷酸酶血癥患者存在c.18del 和c.G407C 復合雜合變異，但c.G407C 變異臨床意義不明確，患兒臨床表現為門齒脫落，雙側橈骨、右股骨彎曲畸形，右下肢較左下肢短等，血ALP 19U/L（正常值42～390U/L），長骨彎曲表現與本研究一致。另一個變異c.979T＞C 為錯義變異，功能預測軟件結果偏向于致病性變異，導致ALPL 基因編碼的第372 位氨基酸苯丙氨酸變成亮氨酸，從而影響了酶的活性。該變異有多例HPP 患者文獻報道，其中有13 例是c.979T＞C與c.1559delT 致病性變異形成的復合雜合變異[10]，并且功能實驗提示該變異會導致酶的活性降低至野生型的70%左右[11]。研究表明，在HPP 患者中觀察到的表型異質性極高，主要是由于ALPL 基因的錯義變異導致殘余酶活性不同引起的[12]。上述ALPL 基因兩個變異分別來自父母雙方，符合常染色體隱性遺傳病，結合胎兒超聲提示的股骨和肱骨各自成角表現，診斷胎兒為首例c.18del 和c.979T＞C 復合雜合變異的HPP。由于嚴重的圍生期致死型，可以引起骨骼礦化異常而導致死產，或者出生后新生兒期因骨骼畸形、鈣磷代謝異常、廣泛礦化不良或者肺發育不良而死亡[13]。孕婦最終選擇引產，引產后我們對死胎進行全身X 線檢查，顯示肱骨、尺骨、橈骨以及股骨、脛骨皆有成角彎曲現象（見圖3），提示預后不良。而產前診斷超聲只顯示肱骨和股骨彎曲，可能是由于胎兒在體內體位原因導致某些骨骼異常顯示不清。由于該病呈常染色體隱性遺傳方式，所以本例夫婦再生育胎兒患病風險為25%，可嘗試自然懷孕后適時產前診斷或者直接選擇第三代試管獲得健康嬰兒。

圖3 死胎全身X 線圖（四肢長骨彎曲成角）

綜上所述，ALPL 基因存c.18del 和c.979T＞C 復合雜合變異很可能是這例HPP 胎兒的骨骼異常原因，為HPP 的遺傳咨詢以及產前診斷提供了可靠的依據。