基于根伸長測試終點的小白菜Cd 及Se-Cd 物種敏感性分布

胡 翔，李湘凌,2*，張忠恩，趙 燕，盧新哲，魏迎春

1.合肥工業大學資源與環境工程學院，安徽 合肥 230009

2.安徽省礦產資源與礦山環境工程技術研究中心，安徽 合肥 230009

3.自然資源部平原區農用地生態評價與修復工程技術創新中心，浙江 杭州 311200

4.浙江省地質調查院，浙江 杭州 311200

Cd(鎘)是一種廣泛存在于土壤環境中的有毒重金屬[1-2]，可導致植物生物量生產、養分獲取、抗氧化酶活性和光合作用等生理過程惡化[3-5]，同時易累積在植物可食用部分并進入食物鏈危害人類健康[6-8].2014 年《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，Cd 為我國農田土壤點位超標率最高的重金屬[9]，以暴露劑量-效應為核心的Cd 生態風險評價受到了廣泛關注[8-11].Se(硒)是人類必需的微量營養元素，攝入適量Se 可提高人體免疫能力，發展富Se 農產品產業成為農業結構調整的重要措施[12]，而富Se 環境下的Cd 毒性變化是富Se 農產品產業發展必須考慮的因素.現有研究表明，Se 對Cd 毒性影響具有雙重效應，一方面Se能抑制植物體內的過氧化作用，恢復細胞膜結構和功能的完整性[13-14]，降低重金屬引起的氧化應激[15]，減輕重金屬Cd 對植物的生理毒性[16-17]；另一方面Se 會破壞細胞膜增強Cd 滲透作用，導致Cd 毒性加劇[18-19].但是，關于Se 影響下的Cd 劑量-效應關系及毒性閾值的研究鮮有報道，因此加強Se-Cd 復合作用下的相關研究對農產品的Cd 生態風險控制具有積極意義.

小白菜(Pai-Tsai，Brassica chinensisL.)是我國種植面積大、產量高、經濟價值高的葉類蔬菜之一，其品種多樣，不同品種間Cd 毒性效應差異較大[20-21].考慮到種子萌發期是小白菜等植物最早受環境脅迫的階段[10,22-23]，且由于根直接與污染物接觸、對污染物敏感性較強，其直接影響后期植物生長、生物量和品質，因此眾多研究者將根伸長作為污染物毒性效應研究的表征終點[3,24-25].該研究以種子萌發期根伸長為表征終點開展Cd 暴露劑量-效應關系研究，可有效篩選出小白菜Cd 耐性品種，為小白菜的種植提供參考.

物種敏感性分布 SSD (species sensitivity distribution)常用于水體環境[26-27]、整個生態系統[28]或同一物種的不同品種[29]的生態風險閾值研究，該方法通過概率分布模型將不同物種(品種)的效應濃度進行合理外推，確定對環境中95%物種(品種)具有保護作用的最大環境有害濃度HC5(hazardours concentration for 5% of species)[30-31].現有研究主要采用Log-logistic、Log-normal 和Burr-Ⅲ等分布模型進行SSD 曲線擬合，其中Burr-Ⅲ分布模型因具有靈活性、擬合特性較好等優點被廣泛應用[30-33].利用SSD不僅能夠有效估算小白菜的Cd 毒性閾值，而且可以探究Se 對小白菜Cd 毒性閾值的影響，彌補相關研究的不足，為富Se 環境下的Cd 毒性閾值確定提供參考.

該研究采用國際種子檢驗協會測試協議中的培養皿濾紙法[34]，選取種子萌發期的根伸長作為測試終點，探究Cd 及Se-Cd 對11 種小白菜萌發期根伸長的毒性效應，采用Log-logistic 模型及低劑量Hormesis興奮效應模型進行劑量-效應曲線擬合，得到不同比例效應濃度數據，并基于Burr-Ⅲ分布模型外推得到小白菜SSD 曲線和毒性閾值.通過研究可確定小白菜的Cd 及Se-Cd 暴露劑量-效應關系，篩選出Cd 耐性品種，以期為小白菜Cd 生態風險評價及控制提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試試劑：分析純氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)、亞硒酸鈉(Na2SeO3).

供試小白菜：AJH(矮腳黃)、BBQ(八寶青)、HYG(黑油冠)、GGB(高梗白)、SYM(四月慢)、SG259(蘇冠259)、YDE(油冬兒)、SHQ(上海青)、SZQ(蘇州青)、KR(抗熱)和NY(奶油) 11 種小白菜種子，購于合肥市合豐種業有限公司等多個蔬菜種子公司.

1.2 試驗方法

該研究采用培養皿濾紙法[34]分別開展Cd 及Se-Cd 作用下11 種小白菜萌發期的根伸長試驗，并根據實際情況稍做修改.

Se、Cd 濃度設置：根據預試驗結果確定適宜Se濃度為0.6 mg/L，設置11 個Cd 濃度梯度分別為0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、30、40、60 mg/L.Cd 處理組分別添加11 個濃度Cd，Se-Cd 處理組分別添加11 個濃度Cd 和適宜濃度Se (0.6 mg/L)，其中，對照樣品(CK)不添加Cd 和Se.每個處理設置3 個重復.

試驗過程：將種子用去離子水洗凈，3% H2O2浸泡30 min 消毒和打破種子休眠，再用去離子水進行洗凈、浮選處理；然后用鑷子將飽滿種子均勻播種在培養皿中的濾紙上，播種粒數為30 粒，再加入Se、Cd 溶液，蓋好玻璃培養皿，置于人工氣候培養箱(RGX-350ES，350 L，河北博匯儀器有限公司)中避光培養(溫度26 ℃，相對濕度75%）.培養7 d 后[34-35]，用游標卡尺測定根長度，計算不同Cd 及Se-Cd 處理水平下的平均根伸長，并以對照樣品(CK)的根伸長為基準，計算相對根伸長RRE (relative root elongation).

1.3 劑量-效應曲線擬合

一般情況下，采用Log-logistic 模型擬合小白菜Cd 毒性的劑量-效應關系曲線，擬合方程：

式中：Y為不同處理水平下的小白菜相對根伸長，%；X為Cd 濃度，mg/L；y0和b為模型參數；M為EC20Cd或 EC50Cd的自然對數值，其中EC20Cd和EC50Cd分別為20%和50%比例效應濃度，該研究中，即以對照樣品CK 的根伸長為基準，小白菜RRE 抑制水平為20%和50%時對應的Cd 濃度.

當土壤中低濃度Cd 對植物產生較強興奮效應時，采用低劑量Hormesis 興奮效應模型進行毒性效應擬合[36]，擬合方程：

鄉土植物資源是城市植物多樣性最重要的組成部分,對于森林群落來說,鄉土樹種的占比越高,其適應性、穩定性和抗逆性就越好,同時能維持自身的營養平衡,保持自然更新[13]。本研究中鄉土樹種根據《上海植物志》和《華東五省一市植物名錄》確定[11-12]。

式中，a、b、c、d為模型參數，k為效應比例.當k值為20 或50 時，c為相應的效 應比例濃度 EC20Cd或EC50Cd.

1.4 物種敏感性分布曲線擬合

根據1.3 節中式(1)(2)得到的EC20Cd或 EC50Cd，采用Burr-Ⅲ分布模型擬合得到小白菜Cd 物種敏感性分布曲線，分別計算得到保護95%小白菜品種的Cd毒性閾值HC5(基于 EC20Cd和 EC50Cd的Cd 毒性閾值分別為 HC520和HC550)，Burr-Ⅲ分布模型[29,37]：

1.5 數據處理與分析

使用Microsoft Excel 2016、Origin 2018 軟件進行數據整理及圖件制作，使用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析及多重比較.

2 結果與分析

2.1 Cd 及Se-Cd 作用對小白菜根伸長的影響

Cd 處理組中，11 種小白菜的RRE 見圖1(a).品種YDE、HYG 和SZQ 的RRE 隨著Cd 濃度增加，呈現先上升后下降的趨勢，在Cd 濃度為0.1 mg/L 時RRE 最 大〔YDE (102.7%)、HYG (102.7%）和SZQ(103.3%)〕，低濃度Cd(≤1 mg/L)對萌發期根伸長具有刺激抗逆性，可能與小白菜胚乳液化和分解能力增強，暫時產生了積極作用有關[23].品種AJH、SHQ、SG259、SYM、GGB、NY、BBQ、KR 的RRE 隨著Cd濃度增加而降低.顯著性檢驗表明，部分品種在特定Cd 濃度范圍內(AJH 中Cd 濃度為5～60 mg/L，YDE、HYG、SG259、BBQ 和KR 中Cd 濃度為1～60 mg/L，SZQ、SYM 和GGB 中Cd 濃度為2～60 mg/L)的RRE均顯著低于CK，而品種SHQ、NY 在全部Cd 濃度下的RRE 均顯著低于CK.

Se-Cd 處理組中，11 種小白菜的RRE 見圖1(b).全部品種小白菜的RRE 隨著Cd 濃度增加均呈現先上升后下降的趨勢，其中，品種YDE、SHQ、SG259、SZQ、SYM 和KR 在Cd 濃度為5 mg/L 時的RRE 最大，品種AJH、HYG、GGB、NY 和BBQ 在Cd 濃度為10 mg/L 時的RRE 最大.與Cd 處理組比較，Se-Cd 處理組RRE 峰值的增幅明顯，其中YDE、HYG 和SZQ 的RRE 峰值差為32.6%～40.9%，SG259、SYM 和BBQ 的RRE 峰值差為6.5%～9.2%，其余品種的RRE 峰值差為10%～15%.

圖1 不同濃度水平Cd 及Se-Cd 處理下小白菜相對根伸長Fig.1 Relative root elongation response of Pai-Tsai to different concentrations of Cd and Se-Cd

Cd 處理組和Se-Cd 處理組的RRE 隨著Cd 濃度變化具有明顯的差異，在較低Cd 濃度(AJH、YDE、GGB、NY、BBQ、KR、SYM 中Cd 濃度≤20 mg/L；HYG、SZQ 中 C d 濃度≤30 mg/L；SHQ、SG259 中Cd 濃度≤10 mg/L)作用下，Cd 處理組的RRE 均顯著小于Se-Cd 處理組；在較高Cd 濃度作用下，Cd 處理組中大部分品種的RRE 大于Se-Cd 處理組.

2.2 Cd 和Se-Cd 對小白菜根伸長毒性的劑量-效應關系

基于Log-logistic 模型和低劑量Hormesis 興奮效應模型，分別擬合得到11 種小白菜RRE 在Cd 及Se-Cd作用下的Cd 劑量-效應曲線(見圖2).在Cd 處理組中，品種YDE、HYG 和SZQ 的Cd 興奮效應較低(RRE<105%)，基于低劑量Hormesis 興奮效應模型和基于Log-logistic 模型得到的擬合曲線基本相同，該現象與孫聰等[29,36]等研究結果相似.

圖2 不同品種小白菜的Cd 及Se-Cd 劑量-效應關系曲線Fig.2 Cd and Se-Cd dose-effect relationship curves of Pai-Tsai cultivars

與Cd 處理組比較，Se-Cd 處理組所有品種小白菜都具有更明顯的Cd 興奮效應.Cd 處理組(YDE、HYG 和SZQ)中最大興奮效應Cd 濃度為0.1 mg/L，Se-Cd 處理組中最大興奮效應Cd 濃度提高為5～10 mg/L.但當Cd 濃度超過興奮效應濃度后，Se-Cd 處理組中多數品種的RRE 迅速降低，其毒性效應超過Cd處理組，該規律在品種NY 和KR 中尤其突出，但品種SG259 (Cd 濃度為30～60 mg/L)和SYM (Cd 濃度為60 mg/L)受高濃度Cd 作用時，Se-Cd 處理組的毒性效應卻低于Cd 處理組.

基于劑量-效應關系擬合曲線，得到不同品種小白 菜的Cd 效 應比例濃度 EC20Cd和 EC50Cd(見表1).Cd處理組中，品種間 EC20Cd和 EC50Cd差異較大，品種SZQ的EC20Cd(25.10 mg/L)和 EC50Cd(40.25 mg/L)最大，分別為品種NY的EC20Cd(2.03 mg/L)和EC50Cd(8.03 mg/L)的12.36 和5.01 倍.Se-Cd 處理組的品種間EC20Cd和 EC50Cd差距小于Cd 處理組，品種SZQ 的EC20Cd(30.12 mg/L)和EC50Cd(48.45 mg/L)最大，分別為品種SG259 的EC20Cd(8.77 mg/L)和 EC50Cd(14.74 mg/L)的3.43 和3.29 倍.

表1 Cd 及Se-Cd 處理組小白菜相對根伸長的不同比例效應濃度EC20Cd和 EC50Cd Table 1 EC20Cd and EC50Cd of Pai-Tsai cultivars based on relative root elongation response to Cd and Se-Cd mg/L

對比Cd 處理組與Se-Cd 處理組的結果表明，適宜濃度Se 可不同程度地提高小白菜的EC20Cd和EC50Cd，其中品種NY的EC20Cd提高了7.9 倍，EC50Cd提高了2.3 倍，而SZQ 和YDE 的EC20Cd和EC50Cd僅提高了1.2 倍左右.

綜上，適宜濃度Se 對小白菜Cd 毒性的影響具有雙重性，一方面Se 可緩解低濃度Cd 對小白菜的毒性效應，提高Cd 興奮效應；另一方面Se 加劇了高濃度Cd 的毒性效應，Se 可有效提高小白菜的不同比例效應濃度 EC20Cd和 EC50Cd.

2.3 小白菜物種敏感性分布及HC5 值預測

基于小白菜EC20Cd、EC50Cd得到Cd 及Se-Cd 處理組的擬合SSD 曲線(見圖3).結果表明，品種SZQ、YDE、HYG 表現出較強的Cd 耐性，品種NY、SG259、KR 對Cd 較為敏感.圖3 顯示，效應比例(即抑制水平)和添加Se 均能明顯影響小白菜Cd 敏感性分布.

基于不同比例效應濃度(EC20Cd或EC50Cd)得到的小白菜Cd 敏感性排序不同.在不同效應比例下，Cd處理組中的Cd 敏感性品種NY 和耐性品種SZQ、YDE 的敏感性排序基本相同，其余品種的敏感性排序均產生了變化.Se-Cd 處理組中，除品種SG259 和耐性品種SZQ 外，其他品種在不同效應比例下的敏感性排序不同.

Se 不影響Cd 耐性品種SZQ 的敏感性排序，導致Cd 敏感性品種NY 的敏感性排序后移，對Cd 較強耐性品種HYG 和YDE 的敏感性影響較復雜.添加Se 對基于 EC20Cd的小白菜品種敏感性排序〔見圖3(a)(b)〕的影響大于基于 EC50Cd的敏感性排序影響〔見圖3(c)(d)〕.

圖3 不同小白菜品種基于EC20Cd或EC50Cd 的物種敏感性累計分布頻次曲線Fig.3 Cumulative frequency of species sensitivity distributions of Pai-Tsai cultivars based on the EC20Cd and EC50Cd

基于EC20Cd和EC50Cd，采用Burr-III 分布模型分別擬合得到毒性閾值HC520和HC550(見表2).Cd 處理組的HC520和HC550分別為2.94 和11.71 mg/L，Se-Cd 處理組的HC520和HC550分別12.00 和16.28 mg/L.添加適 宜濃度Se，HC520提高了約4.0 倍，HC550提高了約1.4 倍，明顯提高了對95%小白菜品種具有保護作用的最大Cd 濃度.

表2 基于Burr-Ⅲ分布模型擬合的保護95%小白菜品種Cd 的毒性閾值(HC5)Table 2 Hazardours concentration for 5% of species (HC5) of Cd to Pai-Tsai determined with Burr-Ⅲ model

綜上，基于不同效應比例會影響小白菜Cd 敏感性順序，適宜Se 濃度會不同程度影響Cd 對小白菜RRE 的敏感性順序，且有效提高了保護95%小白菜品種不受到Cd 脅迫的毒性閾值.

3 討論

3.1 Cd 毒性效應差異分析

不同品種小白菜的Cd 毒性效應存在較大差異，其中，SZQ、YDE、HYG 為Cd 耐性品種，NY、KR、SG259 為Cd 敏感性品種.耐性品種YDE、HYG 和SZQ 在低濃度Cd (0.1 mg/L)時出現RRE 峰值，存在一定的Cd 興奮效應，其余品種均無Cd 興奮效應，且隨著Cd 濃度增加，全部小白菜均表現出不同程度的毒性效應.Liu 等[37]發現，在Cd 濃度為0.658 mg/kg時對部分小白菜品種生物量有興奮效應，隨著濃度增加，不同小白菜品種的毒性效應具有顯著差異.王文光等[38]研究發現，在低Cd 濃度(≤1 mg/L)下可促進番茄種子萌發，而隨著濃度增加，發芽率、發芽勢和根伸長減少，且不同品種番茄種子對Cd 溶液的敏感性存在一定差異，表達出不同的耐受能力.可見，由于受體或毒性表征終點不同可導致Cd 興奮效應濃度和毒性濃度范圍存在差異.

不同品種小白菜Cd 敏感性的差異較大，該研究發現小白菜品種間EC20Cd最大值是最小值的12 倍以上，最大、最小 EC50Cd相差超過5 倍，效應比例(抑制水平)越低，品種間的比例效應濃度差距越大.孫聰等[29]選取17 個水稻品種研究發現，不同品種Cd 的EC50Cd最大和最小值分別為61.61 和4.3 mg/kg，二者相差約14 倍.張乙涵等[39]探究四環素對8 種不同植物的敏感性差異，發現不同植物之間的EC10Cd相差約16 倍，EC50Cd相差12 倍.因此，選取不同受體或毒性效應比例得到的毒性數據差異性較大，在實際應用中可根據污染物不同毒害程度獲取特定受體的毒性閾值，以保護多數的小白菜品種不受Cd 毒害.

Arshad 等[40]發現，在Cd 脅迫下小麥的SOD、POD活性升高，CAT、AsA 和酚類物質活性降低，導致產量和品質降低.錢雷曉等[41]認為，Cd 可導致小白菜對氮素的吸收代謝紊亂，光合速率降低，且其脅迫響應的程度與小白菜的品種有關.Ronzan 等[6]研究表明，Cd 脅迫水稻時，其根系發育受到抑制，改變了側根原基的組織和發育，對根系結構產生了負面影響，造成生物合成和運輸的紊亂.

3.2 Se 對小白菜Cd 毒性效應的影響

Se 對不同品種小白菜的Cd 毒性效應影響較大.Se 對小白菜的Cd 劑量-效應影響具有雙重作用，在較低Cd 濃度時，Se 有效減緩了Cd 對小白菜的毒性效應，主要表現為低Cd 濃度條件下，Se-Cd 處理組Cd 興奮效應及峰值RRE 對應的Cd 濃度均顯著大于Cd 處理組；較高Cd 濃度時，Se 增強了Cd 對小白菜的毒性效應，顯著抑制小白菜的生長發育.Se 對作物Cd 毒性影響的雙重性已有類似報道，余垚等[42]發現，添加合適濃度Se 后，部分受Cd 脅迫的青菜地上和地下生物量有上升的趨勢；Malik 等[43]研究發現，Se 可以促進植物螯合肽(PC)的形成與提高PC 合成酶的活性，因為PC 含有大量巰基，巰基可絡合Cd 離子，將Cd 轉化為毒性較小的絡合形態，減少對植物的毒害作用.Ding 等[18-19]發現高Cd 濃度條件下，添加Se 可顯著降低細根的比例和破壞細胞膜，導致根系細胞對Cd 滲透增強并加劇Cd 毒性作用.

目前關于Se-Cd 復合作用下系統性的Cd 毒性研究較少.該研究在人工氣候培養箱中采用水培方式開展相關研究，但與土壤環境中的Cd 及Se-Cd 對小白菜的生態效應仍存在一定的差異，有必要進一步采用土培方式開展研究，以提高農田土壤Cd 生態風險控制的實踐意義.

3.3 SSD 曲線的應用

SSD 是一種置信度較高的統計學外推方法，當給出特定效應時，可預測其發生的概率[44].Wheeler等[31]建議樣本量至少需要10～15 種，以使得到的HC5更可靠[44].該試驗選取了11 種小白菜進行研究，樣本量滿足SSD 法的樣本量要求.

EPA 風險評價推薦使用Log-normal 分布模型，新西蘭和澳大利亞則采用Burr-Ⅲ分布模型[31]進行SSD 曲線擬合并確定HC5，王小慶等[32]利用Gamma、Log-normal、Log-logistic、Burr-Ⅲ和Weibull 5 種分布模型來擬合不同類型土壤銅SSD 曲線，發現Burr-Ⅲ分布模型最優.該研究選取Burr-Ⅲ分布模型，基于SSD 探究了Cd 及Se-Cd 對小白菜的RRE 毒性效應，適宜濃度Se 有效提高了小白菜Cd 毒性閾值HC520和HC550，這與Semenzin 等[26]的研究結果一致.基于EC20Cd和EC50Cd得到的HC520和HC550有較大差異，且保護的品種可能發生變化，張乙涵等[39]也發現基于EC10和EC50得到的四環素耐性植物分別為萵苣和玉米，而敏感性品種相同.因此，研究物種敏感性分布和毒性閾值時必須考慮到效應比例及其他污染物共同作用的影響.

4 結論

a) 小白菜品種YDE (油冬兒)、HYG (黑油冠)、SZQ (蘇州青)為Cd 耐性品種，NY (奶油)、SG259 (蘇冠259)、KR (抗熱)為Cd 敏感性品種.低Cd (鎘)濃度(≤1 mg/L)對耐性品種具有興奮效應，且在0.1 mg/L濃度時其相對根伸長RRE 最大，其余品種RRE 均隨Cd 濃度的增加而降低.

b) 適宜濃度Se (硒)對小白菜Cd 毒性影響具有雙重效應，Se 可緩解低濃度Cd 對小白菜尤其是敏感性品種的毒性，增強了高濃度Cd 對多數小白菜品種的毒性，Se 對不同品種小白菜產生雙重效應的Cd 濃度范圍存在較大差異.

c) 適宜濃度的Se 可影響小白菜的Cd 物種敏感性分布，并顯著提高了保護95%小白菜品種不受到Cd 脅迫的毒性閾值，Se-Cd 作用下的H C520(12.00 mg/L)和 HC550(16.28 mg/L)分別為Cd 作用下的4.0 和1.4倍，研究成果為小白菜種植及富Se 環境下的Cd 生態風險控制提供參考.