抗雙鏈DNA抗體室內質控品的制備及性能評價

曹 燁，李 蕾，張曉峰★

（1.南京醫科大學附屬無錫兒童醫院醫學檢驗科，江蘇 無錫 214023；2.南京醫科大學附屬無錫人民醫院醫學檢驗科，江蘇 無錫 214023）

雙鏈DNA（dsDNA）是有核細胞內重要的遺傳物質，抗dsDNA 抗體與細胞核的反應位點位于DNA分子外圍區脫氧核糖核酸框架上，是系統性紅斑狼瘡（SLE）標志性自身抗體，參與SLE 的發病機制[1]，并在疾病進展中發揮極其重要的作用[2]。目前比較成熟的檢測抗dsDNA 抗體的方法有間接免疫熒光試驗（IFA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和近年來逐漸推廣的更為高效精確的化學發光免疫試驗（CLIA）[3]。依據ISO 15189 醫學實驗室國際通行標準要求，必須有嚴格的室內質量控制措施，但目前市場上尚未有高品質的商品化抗dsDNA 抗體定量室內質控品供用。本實驗室通過對檢測自身抗體的患者血清標本的選擇性收集，自制了抗dsDNA 抗體定量室內質控品，并對該質控品的精密度及穩定性進行評估。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

本實驗室檢測抗dsDNA 抗體的儀器為深圳亞輝龍生物科技有限公司提供的YHLO iFlash 3000 型全自動化學發光免疫分析儀，并使用該公司配套的試劑。檢測前先對儀器例行狀態檢查和開機維護，對新裝抗dsDNA 抗體試劑重新定標，確保儀器、試劑均處于性能良好狀態。

1.2 質控品的制備

1.2.1 質控源血清的收集 收集若干份實驗室廢棄的抗dsDNA 抗體高值、低值患者血清標本，收集時剔除溶血、黃疸、脂血等外觀異常及傳染性疾病標志物（甲型肝炎病毒抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體和梅毒抗體等）陽性的標本。將這些血清吸到Eppendorf 離心管中，并編號記錄抗dsDNA 抗體濃度和血樣大致體積，置于-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2.2 質控品制備 收集標本數量足夠后，從冰箱中取出所有血樣，室溫解凍融化。取一個潔凈的250 mL三角燒瓶，先將低值血清用吸管移入燒瓶中，充分混勻，用吸管去除可能出現的大團纖維蛋白沉淀。用少量含防腐劑的亞輝龍化學發光免疫分析儀配套的稀釋液和高值血清調節至約0.5 倍cut-off 值，配制低值質控血清，56℃滅活30 min 后室溫振搖60 min，分裝在10 mL 的一次性塑料尿沉渣管中，擰上蓋子在3500 rpm 的轉速下離心10 min。將上清液再次小心吸入潔凈的三角燒瓶中，振搖2 min 確保充分混勻，按200 μL/ 管分裝在1.5 mL 的Eppendorf 離心管中，蓋緊密封，貼上標簽，做好標記，置于-20℃冰箱中冷凍保存待用。高值質控血清制備時，按照約5 倍cut-off 值的預期靶值估算需要加的血樣量，融化混合，各處理步驟同上述低值質控血清。用低濃度血清和含防腐劑的亞輝龍化學發光免疫分析儀配套的稀釋液配制高值質控品，重復上述滅活、離心、分裝、標記步驟，置于-20℃冰箱中凍存備用。

1.3 自制質控品性能評價

1.3.1 自制質控品初始靶值和批內精密度（瓶間差）的測定 從-20℃冰箱中各取20 管自制高值、低值質控品，室溫放置30 min 充分解凍融化，編號、去蓋后上機檢測抗dsDNA 抗體濃度，分別記錄20 管自制高值、低值質控品的檢測結果，并計算平均值（x） 、標準差（s） 、變異系數（CV%）。

1.3.2 自制質控品穩定性測定 本實驗室日常每周二、周五做2 次標本檢測，每個測定日隨機取出自制高值、低值質控品各1 管，復融后，隨同測定標本一起上機檢測，連續記錄4 個季度抗dsDNA 抗體濃度的檢測結果，分別計算每季度組的x、s、CV%，比較初始靶值與各季度組均值和全年累積均值的差異性，評價自制質控品在-20℃保存狀態下的穩定性。首季度以初始靶值的均值為中心線，第二至第四季度以累積均值為中心線，以相應的x ±2s 為“警告”線，x±3s 為“失控”線，動態繪制各個季度Levey-Jennings質控圖，以13s、22s、R4s、41s、10X作為“失控”規則，對出現“警告”或“失控”的結果進行原因分析，并采取相應措施及時糾正。

1.4 統計學處理

采用SPSS 21 軟件進行數據分析，計算各組x、s、CV%，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩均數比較采用最小顯著性差異法（LSD），P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 自制質控品初始靶值及批內精密度（瓶間差）評價

自制高值、低值質控品批內CV% 分別為5.148%和5.510%，見表1。CV% 值在試劑廠家提供的可接受范圍內（≤10%），符合美國臨床實驗室改進修正案（CLIA 88）中能力驗證對檢測項目分析質量的要求[4]。結果顯示，自制質控品批內精密度較高，瓶間差較小，重復性較好。

表1 自制高值、低值抗dsDNA 抗體質控品批內精密度檢測結果（n=20，U/mL）

2.2 自制質控品穩定性評價

2.2.1 批間精密度評價 高值質控品第一季度到第四季度的CV% 分別為6.155%、6.341%、4.536%、4.807%，低值質控品第一季度到第四季度的CV% 值略高，分別 為7.550%、9.545%、5.478%、8.511%。 高 值、低值質控品全年的季度批間CV% 分別為5.388%、7.612%（見表2）均在試劑廠家提供的試劑說明書中的可接受范圍內（≤15%），符合CLIA 88 中能力驗證對檢測項目分析質量的要求[4]。

2.2.2 初始靶值及各季度均值與全年累積均值比較 自制高值、低值質控品初始靶值、各季度及全年累積x、s、CV% 見表2。經單因素方差分析，自制高值、低值質控品各組間均值統計結果分別為F=0.093，P=0.993 ；F=0.629，P=0.678，二者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。自制高值、低值質控品初始靶值及各季度均值分別與全年累積均值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。結果表明，在-20℃保存條件下，高值、低值質控品的穩定期至少12 個月。

表2 自制高值、低值抗dsDNA 抗體質控品各季度均值與累積均值的比較（U/mL）

2.2.3 自制抗dsDNA 抗體質控品的Levey-Jennings 質控圖 通過20 管自制高值、低值質控品檢測結果，統計出x、s、CV%，設定靶值，制定室內質控的控制線，繪制第一季度Levey-Jennings 質控圖。自第二季度起，以后每個季度的Levey-Jennings 質控圖均依據之前所有質控數據的累積均數和累積標準差繪制，圖1、圖2 分別為兩種自制質控品第一、第四季度的質控圖。高值質控品全年共出現違反12s“警告”規則7 次，頻率為6.7%（7/105）；低值質控品全年共出現違反12s“警告”規則9 次，頻率為8.6%（9/105）。二者平均“警告”頻率為7.62%（16/210）。兩種質控品第一、第二、第三季度均未出現違反13s、22s、R4s、41s、10X“失控”規則現象，僅第四季度高值質控品錄得違反22s“失控”規則一次（第16 至第17 次序號），見圖2。

圖1 第一季度Levey-Jennings 質控圖

圖2 第四季度Levey-Jennings 質控圖

3 討論

抗dsDNA 抗體可通過直接結合自身抗原或其他間接方式形成免疫復合物，沉積在腎小球基底膜，觸發補體級聯反應，導致組織損傷；還可穿入活細胞中，調節基因表達，甚至可誘導腎細胞表型的促纖維化改變[5]。抗dsDNA 抗體滴度與SLE 等疾病的活動度密切相關，動態測定其濃度對SLE 的診斷、療效觀察和預后判斷均有重要意義[6-7]。近年來，越來越多的實驗室開展了抗dsDNA 抗體定量檢測項目。保證抗dsDNA 抗體檢測結果的準確性和可靠性至關重要，其中做好室內質量控制是一個重要手段，但目前市場上少有高質量的抗dsDNA 抗體定值質控品提供，且價格高昂。理想的質控品應具備人血清基質、無傳染性、添加劑和抑菌劑的數量盡可能少、瓶間變異小、穩定性好等優點[4]。國內有學者使用自制抗環瓜氨酸肽抗體、抗角蛋白抗體、抗核周因子質控品來代替商用質控品，性能良好[8]。本實驗室自制的高值、低值抗dsDNA 抗體質控品，批內變異CV% 分別為5.148%和5.510%，瓶間差較小，全年批間總變異CV% 分別為5.388% 和7.612%，符合試劑廠家說明書提供的批內≤10%、批間≤15% 的變異要求，說明本實驗室的自制質控品有較好的精密度。自制高值、低值質控品隨同測定標本一起上機連續檢測4 個季度，初始靶值及各季度均值與全年累積均值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。自制抗dsDNA 抗體質控品的Levey-Jennings 質控圖顯示，高值、低值質控品均出現違反12s 規則的現象，“警告”總頻率為7.62（16/210），一年內僅第四季度出現違反22s“失控”規則1 次。“警告”和“失控”的出現可能是由于實驗室溫度、濕度等環境條件的不穩定，以及不同實驗室技術人員操作的微小差異或儀器的不穩定等因素導致。出現“警告”或“失控”后，經復測質控品或重新校準后再復測質控品，其結果均又回到2s 范圍以內的在控狀態，表明自制質控品的檢測可以較好監視檢測系統的性能狀態。精密度分析和質控圖顯示，低值質控品變異系數較高值質控品略大，應該與0.5 倍的cut-off 低水平質控靶值設定有直接關系，水平越低越趨近于分析方法的線性邊界，變異度趨大，但結果仍處于臨床陰性值區域，因此并不影響質控價值。這些數據分析表明，自制的抗dsDNA 抗體室內質控品精密度較高，在-20℃保存條件下，自制質控品一年內保持穩定，滿足臨床實驗室室內質控品的技術要求。

值得注意的是，為確保順利制備質控品，提高質控品的穩定性，混合質控血清在混勻后必須在室溫下振搖60 min，這樣可以讓混合血清中相應的抗原抗體充分進行中和反應，然后離心去除沉淀物能減少潛在的干擾。另外，為了避免質控品蒸發和外溢對結果造成影響，分裝進Eppendorf 離心管后應注意必須保證離心管密封良好，分裝體積應至少在200 μL 以上，并放在管架上保持直立狀態，置于-20℃冰箱中冷凍保存。本實驗室在長期的工作總結中，利用實驗室廢棄的血清標本先后成功制備了幾乎“零成本”的抗dsDNA 抗體、抗ANA 抗體、抗CCP 抗體、抗MP抗體、抗EBV 抗體等多種室內質控品，性能均良好。這些自制質控品的應用既保證了實驗室結果的準確和質量的穩定，同時又大大降低了科室的支出，對檢驗科以及醫院的降本增效工作作出了應有的貢獻。