脂多糖對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞線粒體功能的作用效應(yīng)

鄧威，陳倩，郭金，張璐懿，龔作炯

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細(xì)菌外膜的組成部分，同時(shí)也是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要微生物觸發(fā)因子[1]。LPS可以激活巨噬細(xì)胞以促進(jìn)多種炎性因子如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ及IL-6等的增加，還可導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，如腸源性內(nèi)毒素血癥[2]。巨噬細(xì)胞是一種功能異質(zhì)性的細(xì)胞群，主要受各種微環(huán)境刺激形成不同的細(xì)胞群[3],在宿主防御病原性感染和宿主炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞(M1型)的經(jīng)典激活,體外實(shí)驗(yàn)中炎性細(xì)胞模型的建立常采用LPS誘導(dǎo)Raw264.7巨噬細(xì)胞，激活的巨噬細(xì)胞需要細(xì)胞內(nèi)代謝的重新編程來實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)臉O化和功能[4]。而LPS不僅可刺激Raw264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性物質(zhì)，而且對(duì)細(xì)胞自身的能量代謝與重新編程等相關(guān)方面也會(huì)產(chǎn)生一定影響，但目前對(duì)此方向研究較少。本實(shí)驗(yàn)主要研究脂多糖對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞氧化磷酸化過程中重要線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ、三羧酸循環(huán)過程中關(guān)鍵酶異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH1)的活性及含量變化和細(xì)胞內(nèi)乳酸含量的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)研究對(duì)象：小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。(2)試藥試劑：脂多糖(LPS)購自美國 Sigma-Aldrich 公司；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。小鼠異檸檬酸脫氫酶酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。乳酸檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所?？?IDH1抗體和GAPDH抗體購自武漢三鷹公司。BCA蛋白定量試劑盒購自武漢碧云天公司。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司。胰酶購自合肥Biosharp公司。(3)儀器設(shè)備：酶標(biāo)儀(美國Perkin Elmer公司，型號(hào)EnSight)； CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號(hào)HERAcell 150i)；離心機(jī)(德國Thermo公司，型號(hào)Heraeus Fresco 21)；顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)BX51)； 超聲碎膜儀(美國Fisher Scientific公司，型號(hào)Model 120)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)于2020年9月—2021年2月在武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞離心,去掉細(xì)胞凍存液后加入DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%鏈霉素—青霉素)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，適當(dāng)濕度環(huán)境中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及生長情況，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞造模：將培養(yǎng)的Raw264.7巨噬細(xì)胞均勻種植于細(xì)胞大皿中，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、高劑量LPS組、中劑量LPS組及低劑量LPS組。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，待細(xì)胞長至約5×106個(gè)/皿密度時(shí)?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞進(jìn)行更換細(xì)胞培養(yǎng)液，不加任何其他藥物處理。高劑量、中劑量和低劑量LPS組分別更換為含10 μg/ml、5 μg/ml 及1 μg/ml LPS細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后待測(cè) 。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性檢測(cè)：以分光光度法檢測(cè)Raw264.7細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性。按照對(duì)應(yīng)操作說明書提取對(duì)應(yīng)的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體后，分別于340 nm、605 nm和550 nm波長處讀取對(duì)應(yīng)的吸光度(OD)值，具體按照說明書公式進(jìn)一步計(jì)算各組Raw264.7細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性。進(jìn)一步控制實(shí)驗(yàn)變量，同時(shí)按照BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)對(duì)應(yīng)的蛋白濃度。

1.3.2 異檸檬酸脫氫酶活性檢測(cè)：采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)。各組Raw264.7細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)，去掉上清液，然后每組細(xì)胞加入PBS 200 μl，再經(jīng)超聲碎膜儀破膜后進(jìn)行檢測(cè)。向預(yù)先包被小鼠異檸檬酸脫氫酶捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物 TMB 顯色，四甲基聯(lián)苯胺(TMB )在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的小鼠IDH1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測(cè)定OD 值，計(jì)算樣品濃度。

1.3.3 異檸檬酸脫氫酶蛋白檢測(cè)： 采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)。 將各組Raw264.7細(xì)胞胰酶消化后置于4 ml EP管內(nèi)，使用超聲碎膜儀進(jìn)行處理后，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量。每組所提取蛋白上樣量為每孔10 μg，電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h；加入一抗4℃搖床過夜，TBST進(jìn)行洗膜，二抗室溫下避光孵育1 h，洗膜后使用Odyssey系統(tǒng)掃描分析。檢測(cè)每組細(xì)胞IDH1蛋白表達(dá)含量。

1.3.4 免疫熒光法檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)IDH1表達(dá)含量：各組Raw264.7細(xì)胞經(jīng)過造模處理后，用細(xì)胞固定液固定25 min, 固定后用PBS清洗3次。0.2%Triton透化20 min后，0.5%BSA封閉30 min。IDH1一抗孵育過夜。次日，二抗孵育1 h，DAPI染核3 min, PBS清洗5次，滴加抗熒光猝滅劑后封片，再于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 乳酸含量檢測(cè)：各組Raw264.7細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)，去掉上清液，然后每組細(xì)胞加入200 μl PBS，再經(jīng)超聲碎膜儀破膜后進(jìn)行檢測(cè)。以NAD+為氫受體，LDH催化乳酸脫氫產(chǎn)生丙酮酸，使NAD+轉(zhuǎn)化成NADH。PMS遞氫使NBT還原為紫色呈色物，呈色物的吸光度在530 nm時(shí)與乳酸含量呈線性關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照南京建成乳酸測(cè)試盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1 各組線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性比較 Raw264.7細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性空白對(duì)照組>低劑量LPS組>中劑量LPS組>高劑量LPS組 (F=139.363、95.123、86.795，P均<0.01)，見圖1。

注: 與空白對(duì)照組比較 ,aP<0.01; 與低劑量LPS組比較,bP<0.01;與中劑量LPS組比較,cP< 0.01

2.2 各組Raw264.7細(xì)胞IDH1活性比較 Raw264.7細(xì)胞IDH1活性空白對(duì)照組、低劑量LPS組、中劑量LPS組、高劑量LPS組分別為32.95±1.35、26.56±0.92、22.61±1.12、16.89±0.79，依次降低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=240.796，P<0.001)。

2.3 各組Raw264.7細(xì)胞內(nèi)IDH1蛋白含量比較

Raw264.7細(xì)胞內(nèi)IDH1蛋白含量空白對(duì)照組、低劑量LPS組、中劑量LPS組、高劑量LPS組分別為0.84±0.03、0.52±0.02、0.33±0.02、0.19±0.02，依次降低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=624.261，P<0.001)，見圖2。

圖2 各組Raw264.7細(xì)胞內(nèi)IDH1蛋白電泳圖

2.4 各組胞質(zhì)內(nèi)IDH1免疫熒光比較 Raw264.7胞質(zhì)內(nèi)IDH1相對(duì)熒光值空白對(duì)照組、低劑量LPS組、中劑量LPS組、高劑量LPS組分別為1.00±0.00、0.82±0.04、0.56±0.02、0.32±0.05,依次降低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=278.540，P<0.001),見圖3(紅色部分為IDH1表達(dá))，見圖3。

2.5 各組細(xì)胞內(nèi)乳酸含量比較 Raw264.7細(xì)胞內(nèi)乳酸含量空白對(duì)照組、低劑量LPS組、中劑量LPS組、高劑量LPS組分別為0.35±0.11、0.73±0.09、0.91±0.13、1.18±0.13，依次升高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.987，P<0.001)。

3 討 論

巨噬細(xì)胞在各種炎性疾病如敗血癥、急性肝衰竭及多種慢性疾病等的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。此外，巨噬細(xì)胞是人體重要的天然性免疫細(xì)胞，廣泛存在于人體各個(gè)組織和器官，正常情況下其處于靜息狀態(tài)。而在感染、內(nèi)毒素(如LPS)等致炎因素刺激下，巨噬細(xì)胞可發(fā)生M1型極化，并釋放多種致炎因子介導(dǎo)炎性反應(yīng)來對(duì)抗感染從而保護(hù)機(jī)體，然而革蘭陰性菌引起的內(nèi)毒素血癥會(huì)使過度激活的巨噬細(xì)胞分泌大量炎性因子，可能會(huì)造成組織器官的功能衰竭[5]。LPS可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性物質(zhì)，涉及的調(diào)控通路主要以TLR4通路及MAPK通路為主[6-7]。不同劑量LPS對(duì)機(jī)體影響不同，將大劑量LPS靜脈注射到動(dòng)物模型體內(nèi)，是常用的膿毒血癥造模方法，且研究指出這種造模方式呈現(xiàn)一種劑量依賴性死亡方式[8]。

圖3 各組Raw264.7細(xì)胞內(nèi)IDH1免疫熒光檢查表現(xiàn) (山羊抗兔Cy3-IDH1染色，×100)

一方面，LPS會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生過度的炎性反應(yīng)。另一方面，LPS也可改變機(jī)體自身免疫細(xì)胞的代謝過程。在三羧酸循環(huán)過程中，異檸檬酸脫氫酶的主要作用是將異檸檬酸轉(zhuǎn)化成α-酮戊二酸，而此反應(yīng)是不可逆的，同時(shí)也是三羧酸循環(huán)中的限速步驟,并且IDH1利用NADP為輔因子可以生成NADPH[9-10]。氧化磷酸化途徑為呼吸鏈復(fù)合體偶聯(lián)生成ATP的過程，是機(jī)體功能的主要方式，而線粒體呼吸鏈復(fù)合體主要參與細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化過程中氫質(zhì)子和電子的傳遞過程[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以通過TLR4通路損害免疫細(xì)胞線粒體呼吸鏈，抑制三羧酸循環(huán)活性[12]。LPS誘導(dǎo)刺激會(huì)使巨噬細(xì)胞中IDH1受到抑制，并且可能與Ⅰ型自分泌干擾素途徑有關(guān)[13]。LPS還可以抑制免疫細(xì)胞的氧化磷酸化途徑，但可通過增強(qiáng)糖酵解途徑代償性快速產(chǎn)生ATP及激活巨噬細(xì)胞所需的底物，部分補(bǔ)償氧化磷酸化所缺失的能量及激活底物[14]。Michelucci等[15]在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LPS可以使三羧酸循環(huán)中異檸檬酸裂解酶與琥珀酸脫氫酶活性下降，從而影響線粒體功能。而在本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可抑制Raw264.7巨噬細(xì)胞的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ的活性來抑制氧化磷酸化途徑，降低異檸檬酸脫氫酶1的活性和蛋白含量來抑制三羧酸循環(huán)活性，且這些改變均與LPS的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性。Jha等[16]研究發(fā)現(xiàn)，更低濃度的LPS可能并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化的減少，提示LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的能量代謝與其劑量密切相關(guān)。

細(xì)胞經(jīng)過糖酵解后產(chǎn)生乳酸，本研究發(fā)現(xiàn)，Raw264.7細(xì)胞內(nèi)乳酸含量在LPS刺激后顯著增加，表明LPS可刺激巨噬細(xì)胞的糖酵解發(fā)生。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在受LPS刺激向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，其代謝也向糖酵解方向重新編程。此外，經(jīng)IDH1途徑生成細(xì)胞內(nèi)NADPH可以起到保護(hù)細(xì)胞免受LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的生理作用[18]。本實(shí)驗(yàn)中低IDH1活性與含量可能會(huì)使其保護(hù)作用喪失,而氧化應(yīng)激也可以促使巨噬細(xì)胞線粒體功能受損，使細(xì)胞向糖酵解重新編程,與相關(guān)研究結(jié)果一致[19]。

結(jié)合既往及本實(shí)驗(yàn)研究，LPS可改變巨噬細(xì)胞自身的代謝情況。細(xì)胞在外界刺激下出現(xiàn)的代謝重新編程也是目前研究的熱點(diǎn)問題。巨噬細(xì)胞的浸潤與極化后代謝重新編程不僅與敗血癥、肝衰竭等急性疾病有關(guān)，還與多種慢性疾病如腫瘤、肥胖、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及自身免疫性疾病等的發(fā)生相關(guān)[20- 21]。因此，對(duì)巨噬細(xì)胞激活過程中細(xì)胞內(nèi)代謝重新編程的特性及其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，將有助于理解生理和病理情況下細(xì)胞代謝與巨噬細(xì)胞功能的雙向作用，為巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病的治療提供新的治療靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

鄧威: 設(shè)計(jì)研究方案，數(shù)據(jù)獲取，實(shí)施研究過程，論文撰寫，論文修改;陳倩、郭金、張璐懿:實(shí)施研究過程，分析研究數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，補(bǔ)充數(shù)據(jù);龔作炯：提出選題及研究方向，論文終審