來鳳藤茶中二氫楊梅素的純化工藝研究

樊慶濤，羅微，劉梁，趙玲，劉華英，子文杰，陳新*

（1.武漢輕工大學生命科學與技術學院，湖北 武漢 430023；2.湖北來鳳騰升香料化工公司，湖北 恩施 445700；3.深圳市櫻落科技有限公司，廣東 深圳 518000）

藤茶，為葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄屬（Ampelopsis Michx.）顯齒蛇葡萄 [Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz）W.T.Wang]的嫩葉，經傳統加工揉制、干燥而成[1]。在享有中國土家第一縣美譽的湖北省來鳳縣，藤茶更是擁有上百年的應用歷史。當地村民除將其作為茶日常飲用外，也使用它來治療內部炎癥、腹瀉等常見疾病[2]。藤茶作為一種新資源食品，其主要活性成分為二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY），除具有黃酮類化合物的一般活性外，還具有解除醇中毒、預防酒精肝、脂肪肝、抑制肝細胞惡化、降低肝癌發病率等作用[3]。目前，國內對藤茶的研究較多，但現有針對藤茶中二氫楊梅素的純化工藝相對繁瑣，耗時長、成本高[4]。本文以來鳳藤茶為原料，嘗試開發一種高效、低成本的藤茶二氫楊梅素生產工藝，為促進其產業化發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶：湖北來鳳騰升香料化工公司；無水乙醇（分析純）:國藥集團化學試劑有限公司；二氫楊梅素標準品：上海源葉生物科技有限公司；磷酸（色譜純）：天津賽孚瑞科技有限公司；甲醇（色譜純）：美國TEDIA天地試劑公司；大孔吸附樹脂（D101、HPD-100、S-8、AB-8）：東鴻化工有限公司。其他試劑均為分析純；試驗用水為二次蒸餾水。大孔吸附樹脂具體參數見表1。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Agilent-1260）：美國安捷倫公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS10型）：美國賽默飛世爾公司；有機微孔濾膜（0.22 μm）：上海興亞凈化材料廠；摩爾超純水器（細胞型-1810A）：重慶摩爾水處理有限公司；旋轉蒸發儀（V-855）：瑞士Buchi公司；電子天平（XS204）：美國梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 DMY高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）標準曲線的建立

精準稱取DMY標準品10 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，制成濃度為0.2 mg/mL的標準品母液，分別用移液槍吸取 1、2、4、6、8、10 mL 標準品母液，用無水乙醇定容至10 mL容量瓶中，配成6個濃度梯度的標準品溶液[5-6]。

色譜柱：Agilent C18（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流動相：甲醇-0.03%磷酸，梯度洗脫（0 min～25 min，甲醇-0.03%磷酸體積比 12 ∶88；25 min～35 min，甲醇-0.03%磷酸體積比 65 ∶35；35 min～40 min，甲醇-0.03%磷酸體積比12∶88）；檢測波長290nm；流速0.7mL/min；柱溫 35℃[7]。

分別將6個濃度梯度的標準品溶液過0.22 μm有機微孔濾膜，裝入進樣瓶，分別進樣10 μL，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得標準曲線。

1.3.2 來鳳藤茶總黃酮的提取及預處理

取來鳳藤茶 2 000 g，在料液比 1∶15（g/mL）、乙醇濃度80%、提取溫度80℃、時間3 h的條件下，水浴加熱提取2次，合并提取液[8]，取1 mL用HPLC測量濃度。將提取液旋蒸濃縮至無醇味后得浸膏，加入5倍體積的蒸餾水混懸，然后分別用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，分別取樣測定各萃取部位中DMY的濃度[9-10]。

1.3.3 靜態吸附試驗篩選大孔吸附樹脂

選擇 D101、HPD100、S-8、AB-8 4 種不同極性的大孔吸附樹脂進行靜態吸附試驗，預處理后用濾紙吸干表面水分，分別稱取10 g裝入錐形瓶中。加入100 mL濃度為50 mg/mL的DMY溶液，分別在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h取樣，分別測量上清液中DMY濃度[11]。待上清液DMY濃度無變化時，確認為樹脂吸附飽和。用濾紙吸干表面水分，平均分4等份，分別用30%、50%、70%、90%乙醇解吸，于 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h 取樣，分別測量上清液中DMY濃度，統計結果計算吸附量和解吸率[12]。

式中：Q 為吸附量，mg/g；D 為解吸率，%；M0為上樣液中DMY的質量，g；M1為上清液中DMY的質量，g；M2為解吸液中DMY的質量，g；M3為解吸時上清液中DMY的質量，g；S1為樹脂的質量，g。

1.3.4 動態試驗確定洗脫溶劑

選取靜態吸附試驗選出的樹脂，預處理后濕法裝入10 cm×100 cm層析柱中，用水平衡。采用干法上樣方式將萃取浸膏于10%乙醇中與大孔吸附樹脂以質量比1∶1混勻，平均分成4等份，用水洗至無色無醇味無黃酮泄露后，分別以30%、50%、70%、90%乙醇為起點進行梯度洗脫，流速控制在80 mL/min。以甲酸∶二氯甲烷 ∶乙酸乙酯（1∶4∶5，體積比）為展開劑，DMY標準品做對照，用薄層色譜法（thin—layer chromatography，TLC）監測洗脫[13-14]，收集洗脫液，濃縮、真空干燥后得晶體粉末。

1.3.5 DMY樣品的純度測定

取制備所得的晶體粉末采用1.3.1中的HPLC條件進行純度測定[15-20]。

2 結果與分析

2.1 來鳳藤茶提取液的預處理結果分析

按照1.3.1的方法繪制DMY標準曲線結果見圖1。

圖1 二氫楊梅素標準曲線Fig.1 The standard curve of DMY

由圖1可知，標準曲線方程為y=34036x+20.292，R2=0.999 7，通過HPLC檢測，提取液中的DMY濃度為3.95 mg/mL。對4個萃取部位萃取液和剩余水溶液分別用HPLC分析，結果見圖2。

圖2 不同溶劑萃取液中DMY的含量Fig.2 The content of DMY in different solvent extracts

由圖2可知，萃取后的DMY分別分布在二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇中，石油醚和剩余部分未檢出DMY，其中乙酸乙酯部位DMY含量最高，占總量的96%。

2.2 大孔樹脂靜態吸附篩選結果

4種大孔樹脂預處理后，進行DMY的靜態吸附試驗，計算得各樹脂對DMY的吸附量與解吸率，結果見圖3～圖7。

圖3 靜態吸附吸附量結果Fig.3 Results of static adsorption capacity

圖4 30%濃度乙醇溶液解吸率結果Fig.4 Results of resolution rate of 30% ethanol solution

圖5 50%濃度乙醇溶液解吸率結果Fig.5 Results of resolution rate of 50% ethanol solution

圖6 70%濃度乙醇溶液解吸率結果Fig.6 Results of resolution rate of 70% ethanol solution

圖7 90%濃度乙醇溶液解吸率結果Fig.7 Results of resolution rate of 90% ethanol solution

由圖3可知，樹脂S-8吸附效果最好，吸附量最高可達18.0 mg/g；HPD-100和AB-8次之，吸附量為14.1 mg/g；D101吸附效果較差，最高吸附量僅為9.1 mg/g。由圖4～圖7可知，當乙醇作為洗脫液解吸時，大部分DMY均可被洗脫下來。隨著乙醇濃度的增大，解吸率變化不大，除S-8的解吸率較低，在69%～73%之間，其余3種樹脂對DMY的解吸率均在80%～87%范圍內。結合樹脂對DMY的吸附與解吸附效果，選擇HPD-100樹脂進行動態吸附試驗。

2.3 大孔樹脂動態吸附結果

HPD-100大孔樹脂動態吸附結果見表2，4組試驗分別以不同濃度乙醇作為起點梯度洗脫，利用TLC監測洗脫結果見圖8。

表2 不同濃度乙醇溶液洗脫對比Table 2 Comparison of different concentrations of ethanol solution elution

圖8 不同濃度乙醇洗脫薄層色譜圖Fig.8 TLC of different concentration ethanol elution

由圖8可以看出，在每組的洗脫試驗中，DMY都集中在最開始使用的洗脫劑的洗脫液中。雖然高濃度乙醇可以以更少的柱體積洗脫出DMY，但低濃度的乙醇洗脫可以得到純度更高的樣品。試驗表明，高濃度乙醇洗脫下的洗脫液雜質較多，濃縮時易起泡，增加控制難度，不利于產業化生產。但低濃度乙醇與之相反，在濃縮過程中隨著乙醇濃度降低，樣品會主動結晶析出，可得到純度大于95%的DMY樣品，有利于簡化生產過程中的后期處理。

2.4 DMY純度測定

將提取的DMY樣品與標準品HPLC圖譜比對如圖9～圖10，在相同保留時間下，通過計算峰面積比值得樣品純度為95.4%。

圖9 DMY標準品液相色譜Fig.9 Liquid chromatogram of DMY standard

圖10 樣品液相色譜Fig.10 Sample liquid chromatogram

3 結論

通過對萃取溶劑的考察，提取液中96%的DMY可以經過萃取，轉移至乙酸乙酯部位。在靜態吸附考察中，對比4種大孔吸附樹脂，HPD-100樹脂對DMY的吸附和解吸效果均高于其他樹脂。其對DMY的吸附量最高可達到14.1 mg/g，解吸率可達到87%以上。在動態吸附考察中，30%乙醇溶液做洗脫劑，3.5 BV可洗脫下95%以上的DMY，濃縮干燥后，純度達到95.4%以上。此方法試驗工藝條件簡單，不需要同時串聯多個色譜柱，不需要采取多次水重結晶或其他方法即可獲得較高純度的DMY。同時，采用30%濃度乙醇洗脫使成本降低，安全性增高，適合工業化生產。