基于拉曼光譜技術的冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白及其酶活性檢測

張同剛，韓斌，李靜

（泰山學院生物與釀酒工程學院，山東 泰安 271000）

肉色是影響消費者對肉及其制品購買欲望的首要因素之一[1-2]。動物宰后的胴體顏色主要是由3種不同氧化形態的肌紅蛋白相對含量來決定的[3-6]。阮振甜等[7]研究秦川牛宰后肉色與其肉質品質的相關性，得出在胴體排酸過程中，亮度值與紅度值先上升后下降。趙莉君等[8]研究保鮮膜包裹對貯藏中冷鮮肉肉色的影響，得出保鮮膜有助于肉色的穩定性。黃輝鳳[9]研究肉色與血紅蛋白濃度的相關性研究，探討血紅蛋白作為豬肉品質關鍵性狀肉色穩定性的間接性、標志性指標，為今后活體動物肉色無損預測提供科學數據與技術支撐。拉曼光譜技術能體現分子的振動或轉動信息，通過峰的位置、強度、形狀等信息[10-14]，反映被測樣品分子的官能團或化學鍵的特征振動頻率，提供散射分子的結構信息，用于檢測不同狀態食品分子結構的變化[15-22]。

本文旨在通過以冷鮮牛肉為研究對象，基于拉曼光譜技術，建立一種適用于冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白相對含量與其還原酶活性的無損、快速檢測方法，為冷鮮牛肉貯藏過程中肉色褐變速率及控制方法提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛背最長肌：寧夏鹽池縣大夏農林牧開發有限公司；乳酸、蔗糖、高鐵氰化鉀、鹽酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic，EDTA）、還原型輔酶Ⅰ（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[Tri（hydroxymethyl）amino methane hydrochloride，Tris-HCl]緩沖液（均為分析純）：寧夏西夏生物試劑公司；馬心肌紅蛋白溶液：美國Sigma公司。

1.2 儀器

Inspector 300拉曼光譜儀：美國賽普斯公司；HH.SY21-Ni6-C高速組織搗碎機：江蘇金壇市億通電子有限公司；UV-1200紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取寧夏本地2歲～3歲齡的魯西黃牛作為研究對象。宰后，立刻將背最長肌從修整好的胴體取下，在0℃～4℃的環境中真空包裝儲存；取5 mL馬心肌紅蛋白溶液，加入 50 mg K3[Fe（CN）6]反應 15 min，然后離心10 min（3 500 g、4 ℃），上清液通過 Tris-HCl緩沖液（4℃、50 mmol/L、pH 7.0）透析除去溶液中多余的K3[Fe（CN）6]，即得到高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）溶液。

1.3.2 高鐵肌紅蛋白相對含量的測定

參照Krzywicki[23]的方法，取待測樣品表面肉樣1 cm×1 cm×0.5 cm，加入25 mL濃度為0.04 mol/L，pH值為6.8的磷酸緩沖液，在（20±5）℃下均質30 s。避光保存1 h后，離心靜置，取其上清液過濾，用分光光度計在525、545、565、572 nm處測量其吸光度。計算公式如下。

式中：P 為高鐵肌紅蛋白的質量分數，%；R1、R2、R3分別為吸光度比值 A572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.3.3 高鐵肌紅蛋白還原酶活性的測定

1.3.3.1 高鐵肌紅蛋白還原酶粗酶液提取

參照Mikkelsen等[24]的方法，取樣品表面肉樣1cm×1 cm×0.5 cm，加入20 mL 2.0 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH7.0、4℃下均質處理1 min，在12 000 r/min下離心15 min，過濾后，加入 K3[Fe（CN）6]使其溶液濃度過飽和，發生氧化反應，隨后用2.0 mmol/L的磷酸鹽緩沖液透析 24 h（4℃，pH 7.0）。

1.3.3.2 還原酶活性測定

參照Mikkelsen等[24]的方法，在室溫（20± 5）℃，配制pH6.4標準反應混合物，成分如表1所示，空白對照以去離子蒸餾水代替NADH，其它組分不變。

表1 標準反應混合物Table 1 Standard reaction mixture

反應自加入NADH而開始，用分光光度計在580nm波長下進行掃描記錄吸光值。在580 nm波長下氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，MbO2）與 MetMb的吸光值相差最大，二者的摩爾消光系數：12×103L/（mol·cm），通過比較反應前后（在反應線性階段）吸光值的變化，便可計算出MetMb的還原酶活性，計算公式如下。

式中：A0為提取液加入NADH時580 nm下的吸光值；A1為提取液加入NADH 1 min后580 nm下的吸光值；V1為反應體系體積，mL；ε為摩爾消光系數，L/（cm·mol）；V2為樣品體積，mL；l為比色杯光徑，cm；m為樣品的質量，g。

1.3.4 拉曼光譜測定

取冷鮮牛肉樣品表面肉樣2 cm×2 cm×0.5 cm置于Inspector 300拉曼光譜儀鏡頭下進行測定，激光波長為785 nm，功率為10 mW，掃描范圍為400 cm-1～1 700 cm-1，聚焦深度為 200 μm。試驗用 Savitzky-Golay平滑濾波方法進行拉曼光譜數據曲線平滑處理，采用8點平滑。

1.4 數據處理

光譜數據通過Unscrambler X 10.3（CAMO Software AS，OSLO，Norway）軟件處理。選取偏最小二乘回歸方法建立模型，采用校正集、交互驗證、預測集決定系數、剩余預測偏差、均方根校正、交互驗證、預測誤差進行評估。模型最后采用交互驗證進行評價。

2 結果與分析

2.1 表面高鐵肌紅蛋白相對含量及其還原酶活性的測定

選取120個樣本作為試驗對象，隨機選取其中的100個樣本作為試驗的校正集，其余的20個樣本作為試驗的預測集，并將樣本中的最大值和最小值放入試驗校正集中，確保校正集的容括性，不同高鐵肌紅蛋白相對含量及其高鐵肌紅蛋白還原酶活性見表2。

表2 高鐵肌紅蛋白相對含量及其還原酶活性Table 2 The relative content of MetMb and MRA of beef meat samples

2.2 光譜數據分析

冷鮮牛肉樣品表面原始拉曼光譜掃描結果如圖1所示。

圖1 冷鮮牛肉樣本表面的原始拉曼光譜圖Fig.1 Raw Raman spectroscopy of fresh beef samples

由圖1可知，拉曼位移570 cm-1的峰歸屬于高鐵肌紅蛋白中鐵離子和氧氣間化學鍵的（Fe-O2）伸縮振動，當570 cm-1附近的拉曼光譜峰強度開始減弱時，表明高鐵肌紅蛋白中鐵離子和氧氣間化學鍵開始發生斷裂，此時高鐵肌紅蛋白的相對含量開始逐漸增加；樣品原始光譜數據中還包含了一些無關的干擾因素（暗電流、背景光等），使得拉曼光譜的曲線出現一定的基線漂移，本試驗利用常見光譜數據預處理方法，改善建模效果，減少干擾信息，結合偏最小二乘回歸法（partial least squares regression，PLSR）建立模型，比較分析特征波段與全波段建立模型的效果。

2.3 光譜預處理

選擇最佳的光譜預處理方法，對開始采集的原始光譜數據使用多元散射校正（multiplicative scattering correction，MSC）、歸一化（normalization，Nor）、移動平均平滑（moving average，MA）、S-G 卷積平滑（savitzkygolay，SGS）、標準正態化（standard normalized variate，SNV）、中值濾波（median filter，MF）、一階導數（first derivation，1st Der）方法進行預處理分析，選取PLSR建立冷鮮牛肉表面的MetMb相對含量與高鐵肌紅蛋白還原能力（metmyoglobin reducing activity，MRA）的預測模型，并與原始光譜數據進行比較，見表3。

表3 冷鮮牛肉樣品表面MetMb相對含量與MRA的原始光譜和預處理光譜的偏最小二乘回歸模型Table 3 PLSR models for predicting the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of beef samples with raw and pre-treated spectral data

續表3 冷鮮牛肉樣品表面MetMb相對含量與MRA的原始光譜和預處理光譜的偏最小二乘回歸模型Continue table 3 PLSR models for predicting the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of beef samples with raw and pre-treated spectral data

由表3可知，MetMb經Nor預處理后的拉曼光譜數據建立的預測模型，其R2c和R2p分別為0.825和0.914，均高于其它光譜預處理方法建立的預測模型，且RMSEc和RMSEp分別為0.805與0.723均低于其它光譜預處理模型。通常一個好的模型應該是具有較高的R2值、較低的RMSEc和RMSEp值，且RMSEc和RMSEp差異也是越小越好。因此，選取Nor法作為MetMb的光譜預處理方法。

MRA經SGS預處理后的拉曼光譜建立的預測模型，其R2c和R2p分別為0.782和0.917，均高于其他光譜預處理方法建立的預測模型，且RMSEc和RMSEp分別為0.799與0.827均低于其他光譜預處理模型，因此，選SGS作為MRA的光譜預處理方法。MetMb經Nor預處理和MRA經SGS預處理后的相對分析誤差值（relative percent deviation，RPD） 分別為 4.835與4.183，均大于2.5，表示了良好的預測能力。

2.4 特征波長的提取

原始光譜數中存在216個波段，信息量大，處理時間冗長，其中400 cm-1～900 cm-1光譜曲線存在較大的噪音干擾，因此選擇900 cm-1～1 700 cm-1光譜中提取特征波長，使光譜信息集中在幾個特征波段內。MetMb選擇 8 個特征波長：928、989、1 040、1 107、1 230、1 412、1 473、1 556 cm-1；MRA 選擇 9 個特征波長：989、1 040、1 182、1 240、1 360、1 442、1 535、1 650、1 667cm-1。冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白相對含量與高鐵肌紅蛋白還原酶活性的權重系數圖見圖2。

圖2 冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白相對含量與高鐵肌紅蛋白還原酶活性的權重系數圖Fig.2 Weight coefficient of the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of fresh beef

由圖 2（a）可知，928、989、1 040、1 107、1 230 cm-15個特征波長的光譜反射值與MetMb相對含量呈負相關，而 1 412、1 473、1 556 cm-1處的光譜反射值與MetMb相對含量呈正相關；圖2（b）為冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白還原酶活性權重系數圖，其中989、1 182、1 360、1 535、1 650、1 667cm-1的光譜反射值與 MRA 呈負相關，而1 040、1 240、1 442cm-1處的光譜反射值與MRA呈正相關。由分子振動量子理論可知，分子基團振動方式不同，其吸收波長特征頻率不同，每種物質分子所含基團種類多且差異性強，因此具有特定的波段吸收組合。

2.5 全波段和特征波段下的PLSR模型比較

為對比全波段與特征波段下冷鮮牛肉表面MetMb相對含量與MRA模型的差異性，驗證提取的特征波長的有效性，試驗數據見表4。

表4 全波段和特征波段下的PLSR模型結果Table 4 The PLSR model results under full-wave bands and optimal wavelengths

由表4可知，MetMb相對含量特征波段下的PLSR模型的R2C為 0.827，R2P為 0.916，RPD為 4.893，特征波段校正集與驗證集均高于全波段，且由交互驗證的R2CV與RMSEcv值顯示模型穩健性好；MRA特征波段下 PLSR 模型的 R2C為 0.802，R2P為 0.832，RPD 為4.115，與全波段的模型得到的決定系數差異不大，交互驗證結果顯示預測結果與參比值的偏離值在允許范圍內，模型預測性較好，特征波段下的PLSR模型建立僅需8個～9個波段光譜反射值，與全波段216個波段相比，極大降低了數據冗余量與處理時間，為實現在線快速檢測提供技術條件。通過上述分析，特征波段可以替代全波段光譜數據來建立預測模型。

3 結論

本文利用拉曼光譜技術結合化學計量學方法，建立了冷鮮牛肉表面MetMb相對含量與MRA的PLSR預測模型。選擇900 cm-1～1 700 cm-1波段，進行原始光譜與不同光譜預處理方法比較，得出MetMb經Nor預處理與MRA經SGS處理后能取得較好的校正模型與預測模型。利用PLSR結合加權β系數選擇特征波段，MetMb 相對含量的特征波段為 928、989、1 040、1 107、1 230、1 412、1 473、1 556 cm-1；MRA 的特征波段為989、1 040、1 182、1 240、1 360、1 442、1 535、1 650、1 667 cm-1，特征波段提取與分子基團光譜吸收峰值具有一定相關性。利用特征波段建立的PLSR模型，R2MetMb=0.916，RMSEpMetMb=0.827，RPDMetMb=4.893；R2MRA=0.832，RMSEpMRA=0.905，RPDMRA=4.115，可以替代全波段建立的PLSR模型，表明拉曼光譜技術結合化學計量學方法，預測冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白含量與高鐵肌紅蛋白還原酶活性是可行的。