檸檬酸工業生產菌黑曲霉TNA09基因敲除體系的構建

張久祎，李潔，2，薛鮮麗，2，3，王德培，2，3*，周昊

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；3.天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457；4.日照金禾生化集團股份有限公司，山東 日照 276800）

黑曲霉作為曲霉屬中廣泛應用于發酵工業的重要食品安全性微生物菌種，可生產糖化酶、半纖維素酶和纖維素酶[1]、果膠酶[2]等多種水解酶，同時還是發酵生產有機酸（檸檬酸[3]、蘋果酸[4]、葡萄糖酸等）的重要菌種。高產檸檬酸工業菌株黑曲霉是經過多次物理和化學誘變篩選而來，具有復雜的細胞結構，增加對其進行分子遺傳改造的難度，因此，亟待建立適用于該檸檬酸工業菌株高效的遺傳轉化體系。

絲狀真菌常見的遺傳轉化方法有聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-CaCl2介導的原生質體轉化法、醋酸鋰轉化法、電穿法[5]、根癌農桿菌介導轉化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）[6]。其中PEG介導是指通過化學方法將外源DNA轉移至原生質體細胞，且PEG介導的原生質體轉化法則可以將多基因及多片段同時轉化[7]，該方法已被廣泛應用于絲狀真菌遺傳轉化。原生質體作為良好的瞬時表達系統，可以同時攝取兩個及以上外源質粒或DNA片段以及蛋白酶等大分子物質[8]，且由于其受體細胞數量大，故易獲得純合型轉化子[9]，提高遺傳物質交換和基因重組效率，實現通過同源重組對靶基因進行敲除。Zhang等[10]在出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）中利用原生質體轉化法將含Cas9基因的質粒和一個靶向umps基因的sgRNA共轉化至出芽短梗霉菌，實現將突變引入umps基因使得突變率由4%提升至40%，為PEG介導的原生質體轉化法在出芽短梗霉中的分子改造提供了新思路。Gao等[11]于耐堿性芽孢桿菌中利用電穿孔方法進行轉化但并未成功，改用原生質體轉化法，利用PEG誘導原生質體吸收DNA獲得1.10×105個轉化子/mg質粒DNA，證明原生質體轉化法的廣泛適用性。

目前，在黑曲霉模式菌株中已經成功建立了PEG介導的原生質體轉化方法，王發祥等[12]通過單因素試驗、PB試驗和響應面法對一株產酸性α-淀粉酶黑曲霉的孢子進行了原生質體制備和再生的條件優化，大大提高了原生質體制備率及再生率，為后續的酸性α-淀粉酶高產黑曲霉菌株的原生質體誘變選育工作提供試驗依據。張衛兵等[13]通過混合酶處理產植酸酶黑曲霉PX菌絲，優化原生質體制備和再生的條件，為曲霉孢子原生質體制備提供了參考，也為其后續的原生質體誘變育種提供方便。魯秀婷[14]利用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法將pPTRⅡ-cbh1成功轉入黑曲霉Y14原生質體并成功表達，可見PEG-CaCl2介導的原生質體遺傳轉化對絲狀真菌的遺傳操作是較為有效的方法。但針對成功在工業黑曲霉菌株中建立PEG介導的原生質體轉化方法的鮮見報道，張曉立等[3]將帶有amdS篩選標記的質粒pGm轉化至檸檬酸工業生產黑曲霉菌株中，成功在檸檬酸工業菌株黑曲霉中建立了以原生質體-PEG法介導的遺傳轉化體系，但該研究并未實現將DNA外源片段轉化至原生質體，兩個及以上外源質粒或片段同時轉化至原生質體，故黑曲霉高產檸檬酸工業菌株原生質體再生及轉化條件仍需研究。

盡管絲狀真菌原生質體的分離及制備上的應用研究已有報道，但是黑曲霉高產檸檬酸工業菌株原生質體的轉化體系等相關研究較少。本研究以高產檸檬酸黑曲霉工業菌株TNA09（CGMCC5751）為出發菌株，通過對黑曲霉菌絲培養，及其菌絲最佳酶解條件進行優化，確定最佳原生質體制備及再生體系，以黑曲霉次生代謝物的全局轉錄調節因子laeA[11]基因作為敲除目標，通過PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法將DNA片段轉入細胞中并借助同源重組敲除目的基因；此外，以檸檬酸轉運蛋白cexA基因[12]為敲除目標，通過PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法將外源PFC330質粒及DNA片段轉入細胞實現目的基因敲除。本文通過確定黑曲霉TNA09原生質體制備和再生的最佳條件從而實現黑曲霉檸檬酸工業菌株高效原生質體的制備和轉化，為黑曲霉工業菌株基因工程遺傳改造建立較好的方法，進一步推動高產檸檬酸工業黑曲霉菌株的分子改造過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質粒

黑曲霉工業菌株TNA09（CGMCC5751）：日照金禾博源生化有限公司；用于敲除黑曲霉laeA基因的DNA片段由天津科技大學生化過程與技術實驗室構建；用于敲除黑曲霉cexA基因的PFC330質粒由天津科技大學生化過程與技術實驗室保藏，用于cexA敲除的sgRNA片段由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.1.2 酶及試劑

裂解酶（200 U/mg）、蝸牛酶（40 U/mg）、溶菌酶（20 000 U/mg）：上海索萊寶生物科技有限公司；rTaq酶（5 U/μL）、PrimerSTAR 高保真酶（2.5 U/100μL）：日本TaKaRa公司；山梨醇、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸[2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES]、氯化鈣（CaCl2）、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）（均為分析純）：天津市北方天醫試劑公司。

1.1.3 滲透壓穩定劑及培養基

SMC溶液由山梨醇、MES、CaCl2配制；STC溶液由山梨醇、Tris-HCl、CaCl2配制；TC 溶液由 Tris-HCl、CaCl2配制；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）buffer參考文獻[3]的方法配制；馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養基參考文獻[15]的方法配制；雙層固體CM再生培養基參考文獻[16]的方法配制，上層下層均含2%瓊脂；PDB-溴甲酚綠培養基參考文獻[17]的方法配制。

1.2 儀器與設備

CX23光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司；ChampGel全自動凝膠成像儀：北京賽智創業科技有限公司；Mastercycler X50SPCR儀：德國Eppendorf公司；AELTA 320 pH計：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉菌絲獲得條件的優化

1.3.1.1 不同培養基的選擇

取等量黑曲霉孢子懸液接種至PDB培養基及CM液體培養基，37℃培養，比較不同培養基對孢子萌發生長情況的影響。

1.3.1.2 不同孢子接種量及培養方式的優化

在液體培養基中通過比較不同黑曲霉孢子接種量（1×108、5×107、1×107個黑曲霉孢子）和37℃下不同培養方式（靜置培養、180 r/min搖床液體培養）對孢子萌發的影響。

1.3.1.3 黑曲霉菌絲生長時間的優化

在同一培養條件下，比較黑曲霉菌絲不同培養時間10、14、17、20 h黑曲霉菌絲制備原生質體的觀察。

1.3.2 黑曲霉菌絲最佳酶解條件的優化

1）酶裂解液的配制：復合酶體系為1.50%裂解酶+0.50%蝸牛酶+0.20%溶菌酶。

2）黑曲霉菌絲制備：將濾布和針細濾紙放置于玻璃漏斗，過濾收集新鮮黑曲霉菌絲，無菌水洗滌菌絲后，再用SMC溶液沖洗除去殘留液體培養基。

3）黑曲霉菌絲酶解：取不同質量 0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 g新鮮菌絲于10 mL酶裂解液中，于37℃、100 r/min 條件下酶解 2.00、3.00、3.25、3.50 h，鏡檢觀察原生質體形成及釋放情況，確定最佳酶裂解菌絲質量及最佳酶裂解時間。

1.3.3 黑曲霉原生質體收集

收集原生質體前向裂解液中加入10 mL等體積STC溶液，用大槍頭輕輕上下吹打5次，使附著在菌絲體上原生質體釋放至溶液中。用已滅菌的雙層針細濾紙收集原生質體于新無菌離心管中，于10℃、3 000 r/min離心10 min，棄上清液；以STC輕輕重懸原生質體，于10℃、3 000 r/min離心洗滌3次，最后用 200 μL STC重懸沉淀獲得黑曲霉原生質體懸液，通過血球計數板計算原生質體濃度和得率，用于原生質體再生與轉化。

1.3.4 原生質體的再生

采用雙層平板進行原生質體再生，以CM（含山梨醇）作為底層培養基，采用血球計數板對原生質體數量粗略估計，對收集的原生質體進行梯度稀釋，取適量原生質體混勻至上層再生培養基，于37℃倒置培養3 d～4 d，對生長的菌落進行計數，計算原生質體再生率。原生質體再生率計算公式如下。

式中：N1為第3天萌發菌落數；N2為第2天菌絲萌發菌落數；N3為顯微鏡下觀察原生質體數。

1.3.5 原生質體轉化法介導的laeA基因的敲除及轉化子篩選

于50 mL離心管中依次加入以下轉化體系，輕彈混勻：TNA09原生質體懸液100 μL（原生質體細胞數應達到1×107個/mL）；laeA同源臂、左右臂及Hyg基因的融合片段 10 μL（濃度約 10 μg）；PEG buffer 25 μL，冰浴30 min后緩慢加入1 mL PEG buffer，混勻，精確計時5 min后，依次加入2 mL STC溶液，將上述體系加入CM-Hyg（含山梨醇）上層篩選培養基，混勻后平鋪至90 mm平板上（已有下層CM+山梨醇篩選培養基），正置1 h后于37℃培養箱倒置培養3 d～4 d。

經過潮霉素抗性篩選獲得轉化子，提取基因組以laeA-F/laeA-R引物擴增序列包括laeA同源臂、左右臂及Hyg基因為陽性轉化子，同時出發菌株基因組DNA為陰性對照，檢測是否將laeA基因敲除。

1.3.6 原生質體轉化法介導的cexA基因的敲除及轉化子篩選

于50 mL離心管中依次加入轉化體系，輕彈混勻：黑曲霉TNA09尿嘧啶營養缺陷型菌株的原生質體懸液200 μL（原生質體細胞數應達到2×107個/mL）；含pyrG 篩選標記的 PFC330質粒 5 μL（濃度約 8 μg），sgRNA 片段 15 μL（濃度約 8 μg）；PEG buffer 50 μL，冰浴30 min后緩慢加入2 mL PEG buffer，混勻，精確計時5 min后，依次加入4 mL STC溶液，將上述體系加至CM（含山梨醇）不含尿苷上層初篩板，混勻，平鋪至90 mm平板上（已有下層CM+山梨醇篩選培養基），正置1 h后于37℃培養箱倒置培養3 d～4 d。

經尿嘧啶營養缺陷型回補及PDB-溴甲酚綠篩選獲得轉化子培養60 h觀察產酸圈情況，提取基因組以Cas9-F/Cas9-R引物擴增Cas9基因為可能陽性轉化子，以cexA-F/cexA-R引物跨越靶位點進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增 cexA 基因，轉化子測序比對分析檢測是否將cexA基因敲除。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉菌絲獲得條件的優化

2.1.1 不同培養基對黑曲霉孢子生長的影響

黑曲霉TNA09菌株在不同培養基中菌絲球生長形態見圖1。

圖1 黑曲霉TNA09菌株在不同培養基中菌絲球生長形態Fig.1 The growth morphology of mycelium pellets of Aspergillus niger TNA09 strains in different media

由圖1可知，培養基種類對黑曲霉孢子萌發和菌絲生長有較大影響，CM培養基培養20 h孢子生長緩慢，未萌發成菌絲；而PDB培養基培養20 h孢子萌發較快，菌絲球生長迅速，菌絲細而長，有大量新鮮菌絲產生，菌體量較大，因此PDB液體培養基為原生質體制備的最佳培養基。

2.1.2 不同孢子接種量及培養方式的優化

當相同孢子濃度接種至50 mL培養基時菌絲萌發較慢，約20 h后部分孢子萌發成菌絲，大部分孢子仍呈未萌發狀態；接種至100 mL培養基時，約17 h后大量孢子萌發產生新鮮菌絲；接種至250 mL培養基時，需20 h部分孢子萌發形成菌絲。因此100 mL液體培養基裝液量為原生質體制備的最佳培養條件。

黑曲霉孢子接種量的多少對幼嫩菌絲的形成時間及原生質體的形成影響較大。結果顯示，原生質體制備所需接種最佳孢懸濃度為1×108個/mL，取1 mL菌液接種至100 mL PDB培養基，此條件下大部分孢子呈萌發狀態，菌絲細長，利于原生質體制備及釋放。當接種量過少時，如接種量為1×107個/mL和5×107個/mL時，菌絲培養時間過長，菌絲老化不適宜制備原生質體。

2.1.3 黑曲霉孢子萌發時間的優化

斜面孢子培養時間的控制對形成幼嫩的菌絲球至關重要，黑曲霉TNA09孢子培養時間對原生質體釋放影響見圖2。

圖2 黑曲霉TNA09孢子培養時間對原生質體釋放影響Fig.2 Influence of spore culture time of Aspergillus niger TNA09 on protoplast release

由圖2可知，當培養時間為17 h時，菌絲可以釋放最大數量的原生質體，此時的菌絲細胞壁結構更容易被裂解，最適宜原生質體的制備。培養時間短，導致原生質體釋放量不足；而培養時間過長時，菌絲細胞壁結構成分改變，不適宜原生質體的釋放。

綜合菌絲獲得條件的優化，菌絲生長最佳條件為接種菌齡5 d的黑曲霉孢子1×108個，于100 mL液體培養基，37℃、180 r/min搖床培養。

2.2 黑曲霉菌絲最佳酶解條件的研究

2.2.1 酶解時間的優化

用混合酶處理新鮮菌絲，設定酶解時間為2.00、3.00、3.25、3.50 h 4個時間組，定時取樣觀察原生質體形成情況見圖3。

圖3 不同酶解時間下原生質體釋放及回收情況Fig.3 Release and recovery of protoplasts under different enzymatic hydrolysis time

由圖3可知，酶解時間為3.50 h時菌絲消化過度，原生質體狀態不佳，而酶解3.25 h原生質體釋放情況最佳，故通過血細胞計數板計算原生質體回收數目，濃度可達5×107個/mL，此時制備出的原生質體大小均勻，呈均勻圓球狀且比較穩定、分散性好。菌絲酶解時間過短，菌絲酶解不充分；菌絲酶解時間過長，原生質體開始消解變形，大大影響后續原生質體再生試驗。

黑曲霉菌絲在裂解酶的作用下釋放原生質體，酶解2.00 h（圖3A）菌絲的頂端或其他部位出現細胞膜突起，部分孢子出現質壁分離，基本沒有完整球狀原生質體釋放；3.00 h后（圖3B），菌絲膨脹形成小球體并從菌絲頂端或其他部位釋放原生質體，最后脫離菌絲，此時可見大量的原生質體形成；3.25 h后原生質體細胞壁被完全酶解，大部分菌絲釋放原生質體（圖3C），經原生質體回收獲得球狀體單個或串珠狀排列的原生質體，此時原生質體大小均勻，形態穩定分散性好（圖3E）；3.50 h后菌絲多被酶解成細小的片段（圖3D），由于酶解時間過長消化過度，經原生質體回收出現原生質體殘骸及部分破裂菌絲，說明由于脫壁過于徹底可能給原生質體造成了難以恢復的損傷。因此，高產檸檬酸生產菌株的原生質體制備與再生的最佳酶解時間為3.25 h，且酶解后應盡快除去酶解液，以防止過度裂解，影響原生質體的制備與再生效率。

2.2.2 酶裂解菌體量對原生質體再生影響

酶解菌體量對原生質體形成與再生的影響結果見表1。

表1 酶裂解菌體量對原生質體再生影響Tabel 1 Influence of enzymatic lyzing bacteria on protoplast regeneration

由表1可知，原生質體再生率隨著菌體量增加整體呈現先增后減的趨勢，在酶裂解菌體量為0.70 g時，原生質體的再生率最高達到36%。

2.3 PEG-CaCl2介導的原生質體轉化

2.3.1 PEG-CaCl2介導的原生質體轉化對laeA基因敲除

laeA敲除菌株PCR鑒定見圖4。

圖4 laeA敲除菌株PCR鑒定Fig.4 PCR identification of laeA knockout strain

采用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化方法將帶潮霉素篩選標記的laeA敲除片段轉化至菌株TNA09中（圖 4A），所用原生質體數達 5×106個，在含 150 μL/mL潮霉素平板初篩約80個，在含200 μL/mL潮霉素復篩獲得48個轉化子，隨機選取其中8個轉化子提取基因組進行PCR驗證，從中篩選到2株原位插入陽性轉化子，即laeA基因敲除的轉化子，由圖4B可知，1號泳道為黑曲霉檸檬酸工業菌株TNA09基因組為模板作為陰性對照，PCR擴增出laeA基因條帶，長度為2736 bp；2、3號泳道有唯一的laeA左右臂加Hyg陽性條帶，長度為3 151 bp，說明獲得敲除laeA基因的陽性轉化子，最終成功在高產檸檬酸黑曲霉工業菌株中建立了PEG-CaCl2介導的原生質體轉化方法。

2.3.2 PEG-CaCl2介導的原生質體轉化對cexA基因敲除

菌株50號酸圈觀察及PCR鑒定見圖5。

圖5 菌株酸圈觀察及PCR鑒定Fig.5 Acid circle observation and PCR identification of strain

采用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法對cexA基因敲除，于CM不含尿苷初篩板上挑取61個轉化子至CM溴甲酚綠平板，培養觀察產酸圈，選取產酸圈較不明顯菌株50號及出發菌株TNA09至60 mm CM-溴甲酚綠平板觀察酸圈情況，由圖5可知，60 h后TNA09酸圈明顯，酸圈部分呈黃色，圈徑比達3.10，50號轉化子不產酸，呈藍綠色。

通過PEG-CaCl2介導的黑曲霉原生質體轉化進行基因編輯的瞬時表達，將PFC330質粒及作用于cexA靶基因的sgRNA片段同時轉化至黑曲霉原生質體，對PFC330質粒表達進行檢測，1號泳道為以PFC330為模板作為陽性對照，PCR擴增出Cas9基因條帶，長度為4 128 bp；2號泳道以提取出黑曲霉轉染3 d后的50號轉化子基因組DNA為模板，有唯一的Cas9陽性條帶，長度為4128 bp，說明轉化子實現pyrG回補并成功轉入Cas9基因。

原生質體基因組編輯的突變檢測見圖6。

圖6 原生質體基因組編輯的突變檢測Fig.6 Mutation detection after genome-editing using a protoplast transfection system

對靶向編輯能力進行檢測，以陽性轉化子跨越靶位點的特異性引物（cexA-F/cexA-R）進行PCR擴增，獲得目的片段測序。由圖6可知，被轉化的原生質體基因組DNA存在基因編輯，靶位點序列位于靶基因cexA基因的CDS區，于靶位點后469 bp因脫靶效應造成堿基G替換成A，比對全基因序列，只有該處有堿基替換，導致甘氨酸變異成谷氨酸，初步推測利用Crispr/Cas9基因編輯實現利用原生質體法，將檸檬酸工業黑曲霉TNA09中檸檬酸轉運蛋白cexA基因突變，cexA基因功能喪失，50號轉化子不產酸。實現同時將質粒及外源DNA片段轉化至檸檬酸工業生產菌黑曲霉原生質體，為后期工業黑曲霉菌株基因編輯提供技術平臺。

3 討論與結論

近年來高產檸檬酸黑曲霉工業菌株的分子遺傳改造技術逐漸引起人們重視，建立高效的遺傳操作系統是通向分子改造提升菌株生產性能的關鍵。目前，絲狀真菌的遺傳轉化方法主要有根癌農桿菌轉化方法和PEG-CaCl2介導的原生質體轉化兩種方法，其中原生質體轉化方法可以實現多個質粒或片段同時轉入細胞中。野生型黑曲霉菌株呈發散菌絲狀生長，高產檸檬酸黑曲霉工業菌株TNA09菌絲聚縮成菌絲球形態，菌絲分支多相互纏繞，游離菌絲少且短，細胞壁成分復雜，導致其原生質體的制備較困難，無法獲得大量高質量的原生質體，從而影響工業菌株的遺傳改造。至此，本試驗以檸檬酸工業生產菌株TNA09為研究對象，從新鮮孢子接種量、幼嫩菌絲培養條件、酶解菌絲量以及酶解時間等方面進行研究，最終確定了TNA09獲得較高原生質體數量的最佳條件，即CM培養基斜面培養5 d黑曲霉孢子，以PBD液體培養基100 mL，孢子濃度108個/100 mL 37℃培養17 h，所獲得的菌絲有利于酶解和釋放原生質體，并且原生質體的再生率高。

本研究發現高質量的原生質體的獲得及高再生率[18]是工業菌株原生質體轉化方法的關鍵，且二者受多種因素的影響。例如Gong等[19]通過再生培養基、酶解溫度、酶解時間和滲透穩定劑的研究，確定了纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）原生質體再生和制備的最佳條件，為提高埃坡霉素的產量提供了原生質體改造的依據。Liang等[20]研究不同滲透壓穩定劑對原生質體再生影響，表明滲透壓穩定劑濃度過高或過低，原生質體的制備和再生均會受到嚴重影響，同時滲透壓穩定劑也會影響酶的活性，從而間接影響原生質體的產量；張曉立等[3]研究使用混合酶制備原生質體比單獨使用一種酶的效果好，同樣本研究采用的混合酶系形成的原生質體數量可達5×107個/mL；除此之外，本研究中選擇的PDB作為菌絲生長最佳的培養基培養17 h時可獲得大量菌絲體，而張曉立等[3]所使用的CMA培養基培養菌絲體則需要48 h。同樣酶解時間對原生質體質量和產量影響較大，張曉烜等[21]研究表明，以里氏木霉40359為出發菌株，酶解時間2 h最佳，時間過長或過短都使原生質體質膜受到不同程度損傷。本研究中以黑曲霉TNA09為出發菌株時3.25 h為最佳酶解時間，較其它絲狀真菌酶解處理時間更長，如張曉立等[3]制備工業黑曲霉菌株Co827的衍生菌株原生質體所需時間為2.50 h。總之，制備高質量的原生質體利于提高原生質體再生率以及后續的轉化。

本研究確定了黑曲霉TNA09原生質體制備和再生的最佳條件，采用1.50%裂解酶+0.50%蝸牛酶+0.20%溶菌酶的復合酶體系處理0.70 g菌絲體3.25 h后，可獲得形態完整大小均勻的原生質體，并且原生質體的再生率可達到36%。進而通過PEG-CaCl2介導的原生質轉化方法敲除了黑曲霉中laeA、cexA基因，成功在黑曲霉高產檸檬酸工業菌株TNA09中建立了PEGCaCl2介導的原生質體轉化方法，為后續利用原生質體實現更多DNA轉化和通過同源重組敲除目的基因奠定基礎，進一步推動高產檸檬酸工業黑曲霉菌株的分子改造過程。