脈沖電場提取丹參脂溶性成分

周 程 閆澤垚 劉克富

脈沖電場提取丹參脂溶性成分

周 程 閆澤垚 劉克富

（復旦大學光源與照明工程系 上海 200433）

脈沖電場 電穿孔 提取 丹參酮

0 引言

丹參又名紅根、赤參，為唇形科植物Salvia miltiorrhiza Buge的干燥根和根莖，是一種傳統中藥，其主要成分包括脂溶性丹參酮類化合物（如丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ等）和水溶性丹酚酸類化合物（如丹酚酸、原兒茶醛、迷迭香酸、咖啡酸等），具有抗炎、抗菌、抗氧化、擴張冠狀血管、抗腫瘤等多方面的藥理作用[1-3]。丹參酮的傳統提取法包括浸泡法、滲漉法和回流法等，這些方法耗能耗時，效率較低。近年來一些新的方法被引入，如微波法[4-5]、超聲法[6]、索氏提取法[7]、超臨界流體CO2提取法[8-10]、酶法[11]等，與傳統方法相比，在效率和成本上有大幅度提高，但基本都屬于加壓升溫類技術，各自存在一定的局限性。例如，微波法可導致局部溫度過高。酶法引入新的物質，影響提取液的純度，增加分離與純化難度。運用現代科學理論與方法，開展新的更有效的中藥有效成分提取方法研究顯得十分必要，這對于利用傳統中藥資源，繼承和發展我國傳統中醫藥事業具有重要意義。鑒于此，脈沖電場（Pulsed Electric Field, PEF）方法作為一種新型處理方法，被應用到中藥成分提取中。PEF方法最早用于液體食品滅菌，如今其應用領域不斷擴展，已廣泛應用于基因傳導[12-14]、腫瘤消融[15-21]、成分提取[22-24]等。PEF在極短的時間（ms）內作用于細胞膜上，使跨膜電壓達到臨界值，磷脂分子發生重排，形成貫穿細胞膜的孔道，從而實現成分溶出與提取。目前，應用于丹參成分的PEF提取技術尚未見報道。

本文研究目的在于使用該提取方法進行脂溶性丹參酮類成分的提取。為此，首先研制了固態脈沖電源和基于非對稱平板電極的靜止式處理器。對于影響提取的關鍵參數如電場強度、脈寬、脈沖數等進行單因素實驗，并使用液相色譜（High Perfor- mance Liquid Chromatography, HPLC）方法進行結果表征。同時，使用正交優化方法獲得了丹參酮的最優提取條件。對于外加熱與PEF的協同作用也做了考察，分析了熱敏性丹參酮成分在加熱條件下的不穩定性及熱-電協同提取條件。

1 提取機制

PEF提取方法是將固液混合物置于兩電極之間，反復施以高壓脈沖（典型值20～80kV），從而產生細胞膜的傳導率和通透性增大的生物電磁效應。PEF作用時間非常短，通常在1s以內[25]。目前主要使用電穿孔（electroporation）理論來解釋該效應。

在外電場作用下，離子在細胞膜兩側不平衡分布，形成跨膜電壓，其定義[26]為

跨膜電壓示意圖如圖1所示。

圖1 跨膜電壓示意圖

在球形細胞模型中，跨膜電壓可以通過求解Laplace方程得到，即

該方程的解可表示為Schwan方程[27]，有

式中，為細胞半徑；為與電場方向形成的夾角；為外電場大小；m為細胞膜充電時間常數，可估算為

式中，為細胞半徑；m為細胞膜的膜電容；e為外介質的電導率；i為細胞質的電導率。

細胞膜穿孔機理如圖2所示。當外電場逐漸增大，細胞膜兩側離子濃度差將增大并使得跨膜電壓增大，如圖2a所示。當達到臨界穿孔電壓（約1V）時，膜厚度壓縮且磷脂頭部向內彎折形成貫穿性孔道，并使得細胞膜通透性增加。典型的跨膜電壓變化如圖2b所示，由圖可以看出，一旦達到臨界值，跨膜電壓將迅速跌落并逐漸穩定，直到外加電場消失；而未達到臨界穿孔電壓時，其跨膜電壓表現出典型的膜電容充電與放電特性。

圖2 細胞膜穿孔機理

與此同時，形成的孔道將允許可溶性成分溶出。此擴散過程可以用Fick定律描述為

式中，為濃度；為時間；為擴散系數；為位置或距離。

2 高壓脈沖發生器和處理室

PEF方法通常使用指數衰減波、方波和雙極性波三種波形。在本研究中，使用效率更高的方波，因其在脈沖作用時間內均對細胞膜產生作用，而其他波形僅在臨界值以上部分有效。高壓脈沖電源采用自行研制的固態Marx發生器，其具有波形易于調制、重復頻率高、上升時間短等優點。通過控制開關的導通時序，可以產生所需方波。該發生器共26級，每級3個5mF并聯電容。放電時總等效電容為576nF。最高輸出電壓20kV，最大通流200A。重復頻率0.1～10Hz。脈寬范圍0.5～10ms。

同時，設計靜止式處理器，其截面如圖3所示。該處理室電極采用非對稱結構，由于無三相點處的電子發射，故可以有效減小沿面閃絡的可能性。為減小電極的邊緣效應，提高處理的勻質性和可靠性，電極邊緣應予以倒圓。該處理室有效處理面積約為50cm2。

圖3 靜止式處理器截面

3 實驗方法

3.1 實驗材料與儀器

實驗中使用的試劑與儀器見表1。

表1 實驗試劑與儀器

Tab.1 Experimental reagents and equipments

注：*含丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ。

3.2 丹參粉碎與預浸泡

預處理除去雜質，并將如圖4所示的丹參生藥粉碎約30s。粉碎可使丹參粉粒大小均勻且具有代表性，提高測量結果的準確度。由于藥材比表面積增大，提取率將進一步增大。粉碎過細會使得藥材顆粒之間產生吸附和聚集，溶劑難于穿透。

圖4 丹參

取丹參粗粉，過200目（74mm）篩網。取篩后丹參細粉末，精密稱定。在燒杯中加入40mL無水乙醇（分析純）溶劑，使丹參和乙醇充分混勻，制成懸濁液。

預浸泡30min。浸泡能夠去除藥材中的空氣，增大溶劑與藥材的接觸，并防止電場作用期間氣泡的擊穿。此外還能夠使細胞膨脹，組織軟化并提供一定的初始離子濃度，便于建立跨膜電壓。

3.3 脈沖電場處理

PEF提取系統如圖5所示。圖中，高壓脈沖電源用電容器和開關串聯的形式表示，當驅動電路驅使開關管閉合時，Marx發生器將所儲存的能量向負載釋放。高壓探頭用來測量記錄處理室兩端的脈沖電壓波形。羅氏線圈用來測量回路電流。該線圈接于低壓端（或近地端）。示波器分別記錄電壓和電流波形，實時監測提取系統運行情況。

圖5 PEF提取系統

停止脈沖電場處理后，將提取液用濾紙進行過濾，獲得所需提取溶液。再經過0.22mm尼龍濾膜過濾取樣備檢。提取液不可于溶液狀態久置，因丹參酮成分具有不穩定性，會在溫度、濕度、光線等的影響下隨時間變化，可能造成外觀（顏色）變化、成分降解等。

脈沖Marx發生器放電時負載電壓電流的典型波形如圖6所示。電壓幅值（穩定值）=10kV，電流（平頂）=5A。在電流上升階段（峰值m= 30A），電源主要向膜電容充電，實現跨膜電壓的建立；而在平頂段（=5A）主要是阻性電流，通過膜電阻或溶液等效電阻產生焦耳熱。

圖6 負載典型波形

由于采用乙醇溶劑，負載呈高阻抗特性，因此處理室具有低能量消耗的特點，即主要利用負載電容性效應進行電場處理而不是電阻電流。此處能量傳遞估算為2.6J/mL，由PEF引起的提取液溫升通常小于6℃。

3.4 HPLC分析

以水為流動相A，以甲醇為流動相B，按表2中的規定進行梯度洗脫。流速0.8mL/min，紫外檢測波長270nm，進樣體積10mL。色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，選用安捷倫Eclipse Plus C18反相柱，粒徑5mm，內徑4.6mm，柱長250mm。所有流動相均經超聲波除氣泡。所有的色譜檢測均在恒定溫度（26.5℃）下測定，數據由Empower軟件記錄與處理。

表2 梯度洗脫條件

Tab.2 The gradient elution protocol

為獲知提取液中每種成分的含量，使用外標法進行計算。首先建立各對照品的標準曲線。精密稱定1.56mg丹參酮ⅡA分析對照品，置于10mL量瓶中，同時用乙酸乙酯伴超聲溶解，定容至刻度，搖勻，則配置成0.156mg/mL的母液。分別配制梯度濃度的標準溶液，待0.22mm尼龍濾膜濾過后用移液器取約2mL入樣品瓶，備用進樣。同理，稱定分析對照品隱丹參酮和丹參酮Ⅰ，超聲促溶后，配制梯度濃度的標準溶液，濾過，待進樣。使用前述液相色譜條件分別測定，進樣體積均為10mL。以丹參酮ⅡA（和隱丹參酮、丹參酮Ⅰ）的吸光峰面積和質量濃度進行線性擬合。經整理，以上三種對照品的標準曲線方程（為吸光峰面積；為質量濃度）分別為

結果顯示，各對照品在相應取值范圍內線性關系良好。圖7為分析對照品的HPLC，丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的保留時間依次為13.634min、11.462min和11.115min。

根據峰面積，采用提取所得到的目標成分的質量與所用原料的質量之比計算提取率，即

圖8 提取液的典型HPLC色譜

每組平行實驗至少3次，并分別求其平均值和標準差。

4 結果與討論

4.1 電場強度的影響

圖9描述了不同的電場強度下，在施加1 000個3.5ms寬度脈沖的PEF處理之后獲得的丹參酮產率。結果表明，電場強度對丹參酮的提取率有較為明顯的影響。即使在相對低的電場強度（1.2kV/cm）下，提取率也有一定提升，并且隨著外部電場強度的增加，三種組分的提取率均增加。與低電場強度下不同，從5kV/cm開始，提取率的斜率趨于平坦。當電場強度為35kV/cm時，丹參酮ⅡA的提取率達到最大值約4.36mg/g，比對照組（2.46mg/g）高出77.2%。

圖9 電場強度的影響

提高的提取率是由丹參細胞的通透性增加引起的，其允許額外的丹參酮通過形成的孔道釋放至細胞外。此外，提取產率與電場強度的正相關性與施萬（Schwan）方程一致，即較高的電場強度會感應出較大的跨膜電壓，更容易、更快地達到細胞損傷的臨界條件。在高電場強度下，穿孔范圍分布更廣，數量也將更多，如Smoluchowski方程所述[28-32]。在電場中，除了帶電粒子的高速運動和分布對跨膜電壓的建立和提取率有巨大影響，溶劑分子也有一定影響。隨著電場強度的增大，極性溶劑分子的移動速率亦加快，故導致更多的溶劑進入細胞內部，增大細胞內外的濃度差并加速提取進程。

4.2 脈沖數的影響

脈沖數也是影響提取率的重要因素，在30kV/cm，脈寬為3.5ms時研究脈沖數對提取率的影響，結果如圖10所示。結果表明，1 500個脈沖前，提取產量隨著脈沖數的增加而增加，且在1 500個脈沖時丹參酮ⅡA獲得最大產率（3.86mg/g）。然而，當脈沖數繼續上升至2 500時，提取產率逐漸降低至3.74mg/g。隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的提取率均呈現相似的趨勢。在1 500個脈沖內提高的提取產率可以通過在極短的時間內（在幾個脈沖內）形成孔而增加的孔存在時間來解釋，并且隨后的脈沖作用增加總處理時間以維持孔道的存在，溫度的升高也會促使丹參酮擴散到溶劑中。隨著溫度的升高，細胞膜中的磷脂分子會產生相變，從低溫下的填充凝膠狀結構轉變為高溫下的松散液晶相，從而減小了細胞膜的厚度和機械阻力，因此，PEF與同時產生的歐姆熱效應相耦合會增大對細胞膜的損傷。丹參酮提取率的增加可能表明這種相變的發生，以及升溫條件下膜流動性的變化，其中，細胞膜變薄將使之更容易受到電場的破壞。另一方面，超過1 500個脈沖的提取率下降則可能是由于連續脈沖電場作用導致的斷鍵和溫度的增加，因為累積的熱量亦可導致熱敏性丹參酮的少量降解。

圖10 脈沖數的影響

4.3 脈寬的影響

脈寬對于電穿孔亦存在影響，此處在實驗條件為電場強度30kV/cm，脈沖數1 000下研究脈沖寬度的影響。脈沖寬度的影響如圖11所示。可以看出，在1.5ms之前，丹參酮ⅡA的提取率呈逐漸上升趨勢；1.5ms之后其提取率在3.77～4.02mg/g的小范圍內波動，其他兩種組分也是如此。由此可以推斷，一旦脈沖足夠長，細胞膜電容充電過程（約為1ms）即可達到穿孔效應。脈沖寬度對提取速率沒有顯著影響。也就是說，電壓波形的上升階段，主要代表膜電容的充電過程，在跨膜電壓（即膜電容的電壓）建立和孔隙形成中起著關鍵的作用；而在隨后的脈沖平坦階段，電流主要通過膜電阻或溶液雜散電阻轉換為焦耳熱。對于0.5ms脈寬，由于尚未達到平均充電時間，電穿孔僅在極少數半徑較小的細胞中發生，因細胞膜充電時間常數正比于細胞半徑（見式（4）），故導致丹參酮提取率較低，其中，丹參酮ⅡA僅為2.7mg/g。

圖11 脈沖寬度的影響

4.4 液料比的影響

圖12 液料比對提取率的影響

4.5 溫度與PEF的協同作用

圖13顯示了PEF與溫度（使用水浴保持恒溫）協同作用時，提取前后（30min和70min）的吸光度變化。由圖可知，當未施加PEF時，提取率隨溫度逐漸增加，但增長率較低。大體而言，每升高10℃，濃度增加約10%。施加PEF作用時，隨著溫度從20～70℃上升，丹參酮ⅡA濃度（即吸光度表示）呈現出先升后降趨勢，吸光度從0.750 3(au)增長至1.770 7(au)，隨后逐漸下降，在70℃降至1.212 8(au)。也就是說，超過50℃時，PEF與熱協同作用下產生拮抗作用，丹參酮ⅡA發生降解。50℃時比未處理時增加104%。丹參酮ⅡA具有菲醌結構，對光照、潮濕和高溫均具有不穩定性，對高溫尤為敏感，降解反應始終存在于提取過程中。加熱時，丹參酮的溶出與降解是一個相互“博弈”的動態過程。在溫度較低（50℃以下）時，丹參酮以溶出為主導，由于溫升使得丹參微觀結構變化[33]和孔道加速形成，以及溶質擴散速率大于降解速率，丹參酮ⅡA提取率逐漸上升。50℃后，隨著溫度的繼續升高，雖然電穿孔程度逐漸增大，溶出比例增大，但降解速率亦逐漸增大，表現為丹參酮ⅡA提取率的減小。吸收的熱量引起的分子動能的增加意味著更大比例的分子具有碰撞和反應所需的活化能（活化能不隨溫度升高而變化），分子間有效碰撞次數增大，故降解反應速率增大，丹參酮ⅡA的半衰期縮短。此外，升溫使得分子能級升高，運動速率和分子間碰撞頻率增加，亦加劇了降解反應的發生。

圖13 PEF與溫度協同提取前后吸光度變化

相對于常溫，加熱在帶來更高程度細胞損傷的同時，也可能產生其他“副作用”，如雜質將一同釋放至細胞外，使得下游分離與純化工序更加困難，并可能對丹參酮的結構和功能造成不利影響。因此，適當提高溫度（如選擇50℃臨界點處）并引入PEF，克服了過高的溫度帶來的丹參酮降解效應，較好地保持了其品質，增大了溶質向溶劑的擴散速率，進一步提高了提取率。

4.6 提取工藝的優化

為獲得多參數下的最佳提取條件，使用正交方法進行優化。脈沖電場提取丹參酮的正交實驗結果見表3。

表3 正交實驗

Tab.3 Orthogonal method design

（續）

4.7 電鏡表征

圖14為丹參樣品表面的掃描電鏡圖像。圖14a中經PEF處理的丹參樣品，其表面較為粗糙與坑洼，多處出現內凹缺陷，其截面大體呈圓形。圖14b丹參樣品未經電場處理，可保持其完整性，表面大部分較為平坦，粗糙處亦未觀察到穿孔缺陷。

（a）35kV/cm處理組 （b）對照組

5 結論

采用PEF技術提取丹參酮類化合物的方法是可行的，且具有較高的提取率，能耗低、時間短、對下游工序污染少。PEF為提取中藥成分尤其是熱敏性成分提供了新思路，并展現出良好的應用前景。

致謝：感謝復旦大學藥學院昌軍老師提供的HPLC分析協助。

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Pulsed Electrical Field-Assisted Extraction of Tanshinones from Salvia Miltiorrhiza

（Department of Light Sources and Illuminating Engineering Fudan University Shanghai 200433 China）

Pulsed electric field, electroporation, extraction, tanshinone

10.19595/j.cnki.1000-6753.tces.L90195

TM89

周 程 男，1988年生，博士研究生，研究方向為脈沖功率技術與生物電磁應用。E-mail: chengzhou16@fudan.edu.cn

劉克富 男，1963年生，教授，博士生導師，研究方向為高功率電子學及其生物醫學應用。E-mail: kfliu@fudan.edu.cn（通信作者）

2020-06-30

2020-10-29

國家自然科學基金（51877046）和廣東省季華實驗室（18002U100）資助項目。

（編輯 崔文靜）