孤兒核受體TR4在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的表達變化及浙八味煎劑的干預作用

溫晉鋒 戴澤 鄧凱莉 楊冬雪 楊萍 唐春蘭 周玉平*

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經成為全球主要的慢性肝病［1］。NAFLD 為一組疾病，具體包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。目前對于NAFLD 還沒有批準的治療藥物［3］，而對于NASF、HCC 的治療更是缺乏有效手段［4］。本課題組前期研究證實，基于浙江道地藥材為主的驗方“浙八味煎劑”對NAFLD 及相關的肝纖維化具有明顯的干預效應［5-6］，并獲得了國家發明專利授權［7］，但其機制尚待進一步研究。孤兒核受體TR4（Testicular orphan nuclear receptor 4，TR4）與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗密切相關［8］，基因敲除小鼠模型研究證實TR4 與肝臟脂肪代謝有關［9］，但尚未進一步深入研究其在脂肪肝中的作用及機制。本研究擬通過小鼠模型，探究TR4 蛋白在非酒精性脂肪性肝病動物模型中的表達變化及“浙八味煎劑”的干預作用，旨在進一步探尋NAFLD 的干預靶標，并探究中藥驗方“浙八味煎劑”對NAFLD的療效和機制，為研發安全有效的中藥新藥進行實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8 周齡SPF 級C57BL/6J ♂小鼠，體重（24±3）g，共32 只，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產許可證號SCXK（蘇）2018-0008。動物實驗在寧波大學實驗動物中心進行，動物使用許可證號SYXK（浙）2019-0005，本研究經寧波大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 蛋氨酸-膽堿缺乏飼料（MCD，批號TP3005G）及對照飼料（MCS，批號TP3005Gs）購自南通特洛菲飼料科技有限公司；甘油三酯（TG，批號A110-1-1）、谷丙轉氨酶（ALT，批號C009-2-1）、谷草轉氨酶（AST，批號C010-2-1）、總膽紅素（TBIL，批號C019-1-1）均購自南京建成生物工程研究所。TNF-α（F2163-A）、IL-1β（F2040-A）、IL-6（F2132-A）購自上海科興。BCA 蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit，批號E-BC-K318-M，Elabscience）；油紅O 染色液（批號G1261）購自北京索萊寶科技有限公司；Rabbit Anti TR4（PP-H0107B-00）購自美國RnD Systems 公司；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（批號HC301-01）、辣根酶標記山羊抗鼠IgG（H+L）（批號HS201-01）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（批號HS101-01），購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 方法 （1）動物分組和造模：適應性喂養5 d 后，實驗小鼠隨機分成4 組即正常組（N）、模型組（M）、浙八味煎劑高劑量組（H）、低劑量組（L），每組8 只。除正常組外的小鼠均進行造模，采用蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食誘導+每周一次腹腔注射10% CCl4-橄欖油溶液，劑量為2 mL/kg，共6 周。正常組小鼠僅給予MCS 飼料常規喂養。（2）浙八味煎劑制備及給藥方法：按本課題組建立的方法［7］，浙八味煎劑成人一日劑量：浙貝母12 g、溫郁金12 g、白術15 g、杭白菊12 g、白芍12 g、杭麥冬12 g、玄參12 g、延胡索9 g，生藥量共96 g。取兩劑生藥，常規水煎兩次混合，旋蒸發至濃度為0.7、0.35 g/mL 兩種濃度。按70 kg 成人與小鼠體表面積換算法，小鼠每日每千克體重的高、低劑量分別為14 g 和7 g 生藥量，每日灌胃兩種濃度的藥液為20 mL/kg，自造模第3 周首日開始，每日灌胃一次，共4 周。（3）標本留取方法：6 周末各組動物禁食12 h，麻醉后打開腹腔，下腔靜脈采血，切取肝臟，選1 塊置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于石蠟包埋；另取一葉切成方形，OTC 包埋后液氮速凍用于制備冰凍切片；其余液氮速凍后-70℃保存。（4）生化指標和炎癥因子檢測：炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 均采用ELISA 試劑盒，操作步驟根據說明書進行。血清、TG 含量檢測及ALT、AST、TBil 活性檢測均采用生化試劑盒進行。（5）組織病理學觀察：制作肝組織石蠟切片，行HE 染色、Masson 染色觀察組織炎癥和膠原增生情況。制作肝組織冰凍切片，油紅O 染色觀察肝組織脂肪沉積情況。（6）Western blott：提取組織蛋白，根據BCA 試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行凝膠電泳2 h，后轉PVDF 膜2 h，孵育TR4 一抗，4℃過夜；孵育二抗溶液，室溫放置60 min，化學發光法檢測條帶。軟件分析抗體條帶灰度值，再進行半定量統計。（7）免疫組化：石蠟切片經烤片、脫蠟、水化、抗原修復、消除內源性過氧化物酶、通透預處理后，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗TR4（1 ∶100），放入濕盒中，4℃孵育過夜，取出4℃孵育過夜濕盒，室溫靜置45 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次5 min，滴加HRP（m）（1 ∶100），37℃孵育30 min，PBS 充分淋洗。DAB 顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS 或自來水沖洗1 min 后蘇木精復染3 min，鹽酸酒精分化，返藍，自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 統計學方法 采用GraphPad 9.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 浙八味煎劑對肝組織病理的影響 HE 染色顯示，模型組肝組織可見大量脂肪變性，胞質內充滿脂滴空泡，匯管區炎癥細胞浸潤嚴重，浙八味煎劑干預后脂肪變性和炎癥反應程度都明顯減輕，其中高劑量組效果更好，見圖1。Masson 染色顯示，模型組肝組織膠原沉積明顯增加，竇周可見膠原纖維形成細絲狀甚至粗索狀分布，肝小葉結構紊亂，局部可見纖維組織增生；浙八味煎劑高劑量組干預后膠原沉積明顯減少，見圖2。

圖1 浙八味煎劑對模型小鼠肝臟纖維化的影響。A. Masson染色（×100倍）膠原纖維呈藍色；N：正常組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。B. 膠原容積分數，與正常組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

圖2 浙八味煎劑對模型小鼠肝功能和總膽固醇水平的影響。高脂飲食誘導的脂肪肝小鼠、藥物處理后的脂肪肝小鼠與正常組的血清TG含量（A）、肝組織TG含量（B）、血清AST（C），血清ALT（D）以及Tbil（E）的比較；N：正常組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。注：TG，甘油三酯；ALT谷丙轉氨酶；AST谷草轉氨酶；TBil總膽紅素。與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 浙八味煎劑對肝組織脂質代謝和肝功能的影響 與正常組相比，模型組肝臟中TG 含量、ALT 與AST 活性和TBil 含量顯著升高（P＜0.01），表明模型小鼠出現了脂代謝紊亂和肝臟脂質蓄積，并造成了肝臟損傷；小鼠經浙八味煎劑連續灌胃給藥4 周后，肝組織TG 含量、ALT 與AST 活性和TBil 含量降低，與模型組相比具有差異（P＜0.05 或P＜0.01），提示了浙八味煎劑可以逆轉模型小鼠的肝細胞脂肪變性與損傷，見圖3。

圖3 浙八味煎劑對小鼠肝臟炎癥因子的影響。高脂飲食誘導的脂肪肝小鼠、藥物處理后的脂肪肝小鼠與對照組的IL-1β表達（A）、IL-6 表達（B）、TNF-α表達（C）的比較；N：對照組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 浙八味煎劑對肝組織炎癥反應的影響 通過ELISA 檢測模型小鼠肝組織炎癥因子的表達水平，與正常組相比，模型小鼠肝組織中內IL-1β 表達上調（P＜0.05），浙八味煎劑高劑量組降低模型組IL-1β 的表達（P＜0.05）。IL-6 和TNF-α 的表達在本實驗中未見正常組和模型組有差異，但與模型組相比，浙八味煎劑高劑量組能降低兩個炎癥因子的表達水平，具有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），見圖4。

圖4 免疫組化檢測浙八味煎劑對肝組織TR4蛋白表達的影響。N：正常組，M：模型組，H：浙八味高劑量組，L：浙八味低劑量組

2.4 浙八味煎劑對肝組織TR4 蛋白表達的影響 通過Western blot 和免疫組化觀察了模型小鼠肝組織TR4 蛋白表達變化及浙八味煎劑的干預作用，與正常組相比，模型組肝組織中TR4 蛋白的表達明顯增多，陽性表達主要分布在肝細胞的細胞核及細胞漿（P＜0.01）。浙八味煎劑干預能降低TR4 蛋白的表達，與模型組相比具有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 蛋白免疫印跡檢測浙八味煎劑對肝組織TR4蛋白表達的影響。N：正常組，M：模型組，H：浙八味高劑量組，L：浙八味低劑量組。注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

近年研究顯示，孤兒核受體TR4 與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗密切相關，但尚未進一步深入研究其在脂肪肝中的作用及機制。KIM 等［10］通過TR4 基因敲除小鼠體內實驗及原代肝細胞體外實驗發現，TR4 介導肝臟硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（SCD1）基因表達，降低胰島素的敏感度，而敲除TR4 可以抑制SCD1 表達，并可以減少脂肪沉積及增加胰島素的敏感度。LIU 等［11］研究還發現，空腹和胰高血糖素介導的信號cAMP/PKA 和C/EBP 信號通路可以激活TR4 導致糖異生。此外，TR4在促進脂質代謝中也發揮了重要作用。YOSHIZAWA 研究發現，肝臟組蛋白去乙酰化酶SIRT7 基因敲除小鼠，由于TR4 表達水平的降低，表現出對高脂飲食誘導的肝臟脂肪變、肥胖、糖耐量受損的抵抗作用［12］。KIM等［13］通過基因敲除小鼠研究證實，TR4 調節ApoE 基因表達，TR4 的缺失下調肝細胞中載脂蛋白E/C-I 和C-II 基因表達。

綜上所述，TR4 能導致糖脂代謝紊亂，增加胰島素抵抗，促進甘油三酯在肝臟堆積，但既往的研究主要集中在代謝綜合征領域。由于胰島素抵抗及脂代謝紊亂在NASH 發病機制的關鍵作用，筆者推測TR4 蛋白可能是NAFLD 的發病機制之一。本研究通過建立NAFLD 疾病模型，研究發現在NAFLD 動物模型中，肝組織TR4 蛋白的表達較正常組明顯升高。浙八味煎劑能明顯減少脂肪在肝內沉積，逆轉TR4 蛋白的升高，減輕肝組織的炎癥反應。提示TR4 可能作為浙八味煎劑的效應靶點，從而緩解了非酒精性脂肪性肝病的發展。本研究不足之處為此次研究僅是對TR4 在NASF 模型中表達變化及中藥復方干預作用的一個初步觀察，推測TR4 可能的一個有效的干預靶標，如果需要更明確這一論點，還需要使用TR4-/-小鼠模型進行驗證。