內質網應激預處理保護大鼠肝臟缺血再灌注損傷機制研究

周倜 藍海斌 馬遙 朱劍 高山*

肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷是肝臟外科手術以及肝臟移植中經常遇到的問題。預處理是一種有效的降低肝臟I/R 損傷的方法，在損傷發生前，通過短時間的缺血或低劑量的藥物等低強度刺激，誘導肝細胞的應激，以獲得抵御高強度缺血缺氧的能力。研究表明，在細胞受到因缺血缺氧等因素刺激時，會影響蛋白的正常表達和修飾，導致未折疊蛋白在內質網腔內的聚集，引起細胞的內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ER stress），細胞發生內質網應激的過程中，能夠啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）來使細胞適應外界應激刺激，恢復細胞內環境穩定以及細胞的正常功能［1］。本研究旨在通過藥物預處理誘導大鼠肝臟的內質網應激，觀察其對大鼠肝臟I/R損傷的保護作用，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 衣霉素（Tunicamycin/TM）購自美國Sigma公司，大鼠GRP78、IRE1α 多克隆抗體及小鼠抗GAPDH 抗體購自美國Santacruz 公司，HRP 標記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自上海生工生物技術公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 實驗動物分組 6 周齡SPF 級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠20 只，體重160～180 g，購自江蘇卡文斯實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（蘇）2021-0013）。分籠飼養于標準鼠籠中，5 只/籠，自由飲食，控制溫度范圍為22℃±2℃，濕度范圍為40%～70%，所有動物的飼養及實驗均符合實驗動物倫理標準。所有動物適應環境1 周后，按照隨機數字表法隨機分為4 組，每組5 只，其中空白對照組（Vehicle Sham）按體重予0.9%氯化鈉溶液（1 mL/100 g）腹腔注射，3 d 后僅行開關腹假手術；TM 對照組（TM Sham）動物予100μg/kg 的衣霉素行腹腔內注射，3 d 后行假手術；I/R 損傷組（Vehicle I/R）按體重予0.9%氯化鈉溶液（1 mL/100 g）注射3 d 后行肝臟I/R 損傷手術，TM 預處理組（TM I/R）在行100μg/kg的衣霉素腹腔注射預處理3 d 后行肝臟I/R 損傷處理。

1.3 大鼠缺血再灌注損傷模型的建立 根據文獻報道，本實驗大鼠I/R 損傷模型采用肝中葉及肝左葉（全肝70%）缺血再灌注的方法，具體操作如下：實驗動物于術前1 d 禁食，手術采用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，術中乙醚吸入維持麻醉，麻醉成功后，仰臥位固定于操作臺，背部墊高以暴露手術視野。碘伏消毒手術區域后，沿腹部正中切口剪開腹腔并向兩側牽開暴露肝臟，首先游離肝周圍韌帶及肝葉間韌帶，將肝中葉及肝左葉向上翻起，暴露出供應肝左葉及肝中葉的肝蒂。對照組（Vehicle Sham 組及TM Sham 組）動物進行至此步驟即停止操作，溫鹽水紗布覆蓋切口4 5 min 后關腹。肝I/R 損傷模組（Vehicle I/R 組及TM I/R 組）用微型血管夾鉗夾閉供應肝左葉及肝中葉的肝蒂，隨后用溫鹽水紗布覆蓋腹腔切口，阻斷肝蒂45 min 后放開血管夾，待觀察到缺血肝葉血流重新灌注后，將肝臟小心復位，關腹并消毒切口。肝血流再灌注24 h后，按前述步驟麻醉開腹，取出肝臟標本后處死動物。

1.4 肝臟病理學檢查 肝臟標本取出后置于冰上，迅速用眼科剪在肝臟相同位置剪取一小塊肝臟組織放入干凈的EP 管內保存于液氮中，用于后期蛋白水平檢測。其余部分肝臟固定于10%中性福爾馬林溶液內。經脫水、包埋、烘干后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.5 血清轉氨酶檢查 各組動物分別于術前，假手術或I/R 損傷處理后6 h 及12 h 采用斷尾取血法采集外周血全血1 mL，放置于4℃冰箱內靜置2 h 后，4℃離心5 min（3,000rpm），用移液器吸取上層血清至潔凈EP管內，用全自動血生化分析儀測量血清中谷丙轉氨酶（Alanine transaminase，ALT）及谷草轉氨酶（Alanine transaminase，AST）水平。

1.6 免疫印跡實驗 從液氮中取出保存的肝臟組織樣本放入研缽內，加入少量液氮后迅速研磨至粉末狀，收集組織于離心管內，加入預冷過的裂解液，冰上裂解20 min 后使用超聲裂解10 次，再繼續冰上裂解10 min，充分裂解后放入4℃離心機離心20 min（12,000 rpm），收集上清液，即為蛋白溶液，BCA 法測定蛋白濃度，調整濃度值10 μg/uL 后分裝，采用SDS-PAGE 電泳法電泳后轉膜、抗體雜交、顯色掃描后使用Alpha 軟件處理系統分析目標條帶。

1.7 統計學方法 采用 SPSS 25.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以（±s）表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物血清轉氨酶水平 結果顯示，僅注射0.9%氯化鈉溶液的Vehicle Sham 組動物與TM Sham組動物各時間點兩種轉氨酶水平無顯著差異（圖1 A、B；P＞0.05），兩組動物假手術前后轉氨酶水平無差異（P＞0.05），表明單純TM 腹腔注射不會造成明顯的肝功能損害，是一種較為安全的預處理方式。在行I/R 損傷處理的兩組動物中，血清轉氨酶檢測結果顯示（圖1C、D）：兩組動物血清轉氨酶水平在I/R 損傷處理后均明顯升高，至I/R 損傷后6 h，ALT 及AST 水平升至峰值，但TM I/R 組動物外周血兩種轉氨酶的水平在I/R 損傷后6 h 均顯著低于I/R 對照組（Control）（P＜0.05），I/R損傷6 h 后，兩組動物血清ALT 及AST 均出現下降，提示肝功能逐漸恢復，至I/R 損傷后12 h，Vehicle I/R 組血清ALT 水平仍明顯高于TM 預處理組（P＜0.05），I/R損傷后12 h，兩組間AST 水平無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 各組動物血清轉氨酶水平

2.2 肝臟組織學改變 肝臟標本HE 染色結果顯示（見圖2），Vehicle Sham 組動物肝臟鏡下肝細胞形態正常，大小均勻，排列有序，具有正常的中央靜脈結構；TM Sham 組動物肝臟鏡下可見肝細胞輕度水腫；Vehicle I/R 組肝臟可見肝組織內充血明顯，肝細胞水腫改變，大小不等，排列紊亂，肝細胞片狀壞死，匯管區內可見明顯的炎細胞浸潤； TM I/R 組動物肝臟鏡下可見肝細胞間血細胞及少量炎細胞浸潤，少量肝細胞壞死，肝小葉結構大致正常。

圖2 肝臟組織病理（HE ×200）

2.3 內質網應激標志蛋白GRP78 表達水平 結果顯示（見圖3），Vehicle Sham 組GRP78 水平顯著低于其他組，與Vehicle Sham 組相比，TM Sham 組GRP78 的水平顯著升高，表明100 μg/kg 劑量的TM 預處理能夠引起肝細胞發生明顯的內質網應激反應。與Vehicle I/R 組相比，TM I/R 組GRP78 水平升高更為明顯（P＜0.05）。隨后，檢測了不同處理后，內質網應激信號分子IRE1α 的激活情況，結果顯示，各組動物肝細胞內IRE1α 的水平無顯著差異，但各組動物肝細胞內pT-IRE1α 的水平存在顯著差異，在肝臟發生I/R 損傷時，肝細胞內pTIRE1α 的水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）。同時，TM I/R 組動物發生I/R 損傷后，其肝細胞內pT-IRE1α的水平顯著高于Vehicle I/R 組（P＜0.05）。

圖3 各組肝組織內質網應激相關蛋白表達水平（*P＜0.05）

3 討論

在肝臟外科手術及肝移植過程中，肝臟I/R 損傷是手術醫師經常遇到的問題，常關系到術后肝功能的恢復甚至移植肝的存活。研究表明，肝臟I/R 損傷的病理生理機制主要包括缺血所直接引起細胞缺氧損傷，以及血流再灌注恢復后，肝臟炎性細胞浸潤及細胞氧化應激反應所導致的損傷［2］。為減輕手術過程中肝臟I/R 損傷，臨床醫師探索了眾多方法，缺血預處理被認為是目前預防肝臟I/R 損傷較為有效且實用的手段，預處理能夠使肝臟可以耐受后期手術中更長時間及強度的I/R［3］。但這一方法也存在諸多限制，近年來，通過藥物預處理的方法減輕肝臟I/R 損傷程度正成為研究的熱點，通過在術前給予一定劑量的藥物處理，以達到減輕術中可能需要長時間肝臟缺血阻斷的肝臟I/R 損傷目的［4］。

研究表明，肝臟及多種臟器的I/R 損傷均與內質網應激存在著密切的聯系，發生I/R 損傷時，缺血、缺氧、肝臟內自由基以及炎癥因子的釋放均可導致組織細胞發生內質網應激反應［5-6］。在I/R 發生的早期，缺血缺氧導致肝細胞的蛋白合成功能障礙，大量錯誤折疊蛋白及未折疊蛋白在內質網腔聚集，這會誘發細胞的未折疊蛋白反應（UPR）以適應這一應激，UPR 能夠通過激活一系列細胞內分子通路，減少未折疊蛋白在內質網內的聚集，促進內質網正常功能的恢復［7］。這一特殊的自我保護機制提示可以通過刺激細胞發生內質網應激并誘發UPR 作為減輕I/R 損傷的新策略。

衣霉素是一種特異度的內質網應激誘導藥物，能夠阻礙新生蛋白在內質網腔內的糖基化修飾，從而引發細胞的內質網應激反應［8］。但目前大多衣霉素誘導的內質網應激模型多在細胞實驗中進行，缺少動物體內特異度內質網應激的模型，通過本課題組前期預實驗，建立了衣霉素腹腔注射誘導大鼠肝臟內質網應激的模型，在大鼠肝臟I/R 損傷前3 d 給予100 μg/kg 的衣霉素腹腔注射，能夠明顯減輕I/R 所造成的肝臟損傷。本實驗中，各組動物的血清轉氨酶水平檢測顯示，給予100 μg/kg 衣霉素預處理3 d 后，在接受I/R 損傷處理后，與Vehicle I/R 組相比較，TM I/R 組動物術后外周血清中ALT 及AST 水平均明顯降低（P＜0.05），這一結果說明，在接受衣霉素預處理后，在發生肝臟I/R 損傷時，肝臟損傷程度較輕，預處理對肝臟I/R 起到了保護作用，此外還觀察到，與Vehicle Sham 組相比，TM 組動物ALT 及AST 水平雖然表現出一定程度升高，但與Vehicle I/R 相比，這樣輕度的損害對肝功能的影響較為輕微，且能夠在短時間內恢復正常。術后各組動物的肝臟組織病理學結果也表明，Vehicle I/R 組動物肝臟出現明顯的炎細胞浸潤，I/R 損傷程度較重，而TM I/R 組動物肝臟組織的炎癥反應程度則相對比較輕微。這一結果表明，TM 能夠在不顯著損傷肝功能的基礎上，對肝臟I/R 損傷起到明顯的保護作用。

目前研究認為，在細胞內主要有3 條UPR 信號傳導通路，分別由存在于細胞內質網膜上的三種跨膜蛋白IRE1α、PERK、以及ATF6 感受和傳導，在正常生理狀態下，IRE1α、PERK、以及ATF6 與內質網腔內的葡萄糖調節蛋白78（GRP78/Bip）相結合，處于失活狀態［9］。在細胞發生內質網應激后，內質網腔內的未折疊蛋白能夠與GRP78 相結合，導致GRP78 與IRE1α、PERK、以及ATF6 幾種傳導分子解離，導致這些感受態蛋白的激活，引起一系列下游信號通路的傳導，從而減少錯誤折疊蛋白在內質網內的聚集。因此，GRP78 常被視為細胞發生UPR 的標志性蛋白［10］。在本實驗中，通過免疫印跡的方法檢測了不同分組情況下，肝組織細胞的GRP78 表達水平，實驗結果表明，空白對照組動物的肝臟組織內GRP78 的表達水平顯著低于其他各組（P＜0.05），這就說明在正常的生理狀態下，GRP78在肝臟組織內的表達量較低。而采取TM 腹腔注射后，筆者觀察到肝臟組織內GRP78 的水平顯著升高，表明TM 處理能夠誘發肝細胞發生比較明顯的內質網應激，而這一預處理所誘發的UPR 能夠對肝臟I/R 損傷起到較明顯的保護作用。

在本實驗中，筆者發現在肝臟發生內質網應激及I/R 損傷的過程中，均觀察到IRE1α 通路的激活，免疫印跡實驗結果表明，IRE1α 的表達水平在各組無明顯差異，說明在生理狀況下，IRE1α 處于失活的狀態，而IRE1α 激活的標志是其發生了磷酸化，通過檢測各組肝臟組織標本內磷酸化的IRE1α 水平，Vehicle Sham組的肝臟組織內，磷酸化的IRE1α 水平顯著低于其他組，而TM 預處理及I/R 處理均能夠引起顯著的IRE1α磷酸化水平升高（P＜0.05）。同時，還觀察到，與I/R 組動物相比，TM I/R 組動物肝臟組織內磷酸化IRE1α 的水平升高更為明顯（P＜0.05），但TM 組動物肝臟的損傷程度卻相對較輕，提示IRE1α 的激活及磷酸化可能與TM 預處理對肝臟I/R 損傷的保護作用相關，這一結果提示TM 預處理所引起的IRE1α 的磷酸化激活可能作為一種保護性機制，減輕了I/R 所致的肝臟損傷。

綜上所述，本實驗驗證了TM 預處理對大鼠肝臟I/R 損傷的保護作用，發現IRE1α 的磷酸化激活可能與內質網應激預處理在肝臟I/R 損傷中的保護作用相關，其下游相關分子通路及調控機制有待進一步深入研究。