紫糯小麥籽粒石蠟切片制作技術優化及淀粉粒累積分析

劉 娟，夏文榮，李 運，李 妍，朱元剛，戴忠民

(德州學院，山東德州 253023)

小麥(L．)是我國重要的糧食作物之一，其產量和品質直接影響人類食物供應程度和營養水平。淀粉是小麥籽粒的主要組成成分，可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，一般胚乳淀粉中含有20%～30%直鏈淀粉和70%～80%支鏈淀粉。編碼淀粉合成酶(granule bound starch synthase，GBSS)的waxy基因缺失、突變或遺傳表達障礙會使胚乳中直鏈淀粉的含量減少，支鏈淀粉含量上升，小麥胚乳表現為糯性。小麥籽粒淀粉中直鏈淀粉含量 1%或不含直鏈淀粉的小麥稱為全糯質小麥。小麥籽粒可分為果皮、珠被、珠心組織、胚乳和胚五部分，其中果皮和胚乳是儲存淀粉的主要部位。果皮可分為外果皮、中果皮和內果皮三部分，其中，中果皮薄壁細胞的主要組成成分為淀粉，胚乳細胞可分為糊粉層細胞、胚乳轉移細胞和淀粉胚乳細胞三種類型，淀粉胚乳細胞主要含有淀粉和蛋白質。目前，在糯性小麥淀粉粒形態方面，熊 飛等和劉 智等發現，不同小麥品種成熟籽粒胚乳細胞淀粉體均可分為餅形大淀粉體、橢圓形中型淀粉體、圓球形小淀粉體3種類型，且分布存在差異。蔡瑞國等認為，糯性小麥成熟籽粒中存在A型大淀粉粒和B型小淀粉粒；魯 平等也發現糯性小麥胚乳存在兩種淀粉粒形態。但是從整體結構上研究糯性小麥籽粒發育過程中果皮和胚乳淀粉粒積累的研究鮮見報道。

石蠟組織切片在植物組織和結構形態學等研究中廣泛應用。傳統的石蠟切片制作方法需經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色及封固等多個環節，要制出高質量的切片，每一個步驟的操作都很重要，且對特殊組織材料不能適用，因此需要改進。康海岐等利用PAS(periodie acid-schiff reaction)反應原理，改進了第0～10天的水稻籽粒石蠟切片制作方法。于曉剛等對傳統石蠟切片技術中固綠步驟的染色時間進行了研究，發現花后不同天數的粳稻穎果染色最佳時間差異很大。張潤琪等主要從酒精氯仿混合透明逐級浸蠟等方面改良了石蠟切片技術；Zhang等開發了一種在小麥籽粒灌漿的中后期(開花后28 d和35 d)獲得高質量全組織切片的簡單方法；Yu等利用此法比較研究了糯性和非糯性小麥授粉后第8天、第15天、第27天胚乳淀粉的發育情況。盡管前人對小麥籽粒發育的微觀結構進行了許多研究，但關于糯性小麥發育前期籽粒的特點尚缺少更加細致地報道。本研究以糯性小麥品種山農紫糯2號為試驗材料，對常規石蠟切片制作技術進行改良，并結合光學顯微鏡對授粉后0～14 d的發育期籽粒淀粉粒的積累進行觀察研究，以進一步闡明小麥果皮和胚乳中淀粉粒的發育特征及小麥果皮和胚乳發育的關系，旨在為石蠟切片技術的應用和糯性小麥品質改良提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為山農紫糯2號，于2019年-2020年度種植于山東省德州市農科院試驗農場，大田常規水肥管理。開花時，選擇開花和生長一致的穗中部1、2位籽粒，采用單株掛牌和記號筆點穎相結合的方式進行標記，分別于開花當天(0 d)和花后2、4、6、8、10、12和14 d采集小麥籽粒，每次至少取10粒。

1.2 材料固定

對發育早期(花后0～6 d)籽粒，直接用2.5%戊二醛固定液固定；對于發育8 d及以后的籽粒，先橫切成3段，然后用2.5%戊二醛固定液固定，時間均為24 h以上。

1.3 籽粒形態觀察

取花后不同發育天數的小麥籽粒，于體視顯微鏡(Olympus，SZX10型)下觀察并采集照片。

1.4 石蠟切片的制作

試驗初期根據傳統方法制作石蠟切片，針對出現的問題對小麥籽粒石蠟切片制作過程中的洗脫、透明和浸蠟等環節進行優化。

(1)傳統石蠟切片制作方法 脫水程序為：30%乙醇，1 h→50%乙醇，1 h→70%乙醇，1 h→85%乙醇，1 h→90%乙醇，1 h→95%乙醇，1 h→無水乙醇， 3次，每次1 h。透明程序為：無水乙醇∶二甲苯=1∶1→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ，各1 h。浸蠟程序為：二甲苯∶石蠟= 1∶1，60 ℃保溫12 h；石蠟Ⅰ，60 ℃保溫12 h；石蠟Ⅱ，60 ℃保溫24 h。

(2)優化方法 脫水程序對70%乙醇和無水乙醇處理進行優化，具體見表1。透明程序借鑒張潤琪等的方法。浸蠟方案參考康海岐等的方法設計3種程序，具體見表2。

表1 小麥籽粒不同脫水時間處理Table 1 Treatment of wheat grain with different dehydration time

表2 小麥籽粒不同浸蠟程序Table 2 Different wax soaking procedures of wheat grain

浸蠟后的樣品按常規方法包埋成蠟塊，然后在石蠟切片機(KD-2508，China)上切成10 μm厚的切片，并轉移到粘附載玻片(Citoglas，REF188105W，China)上。常規脫蠟后用0.5%甲苯胺藍染色10 min和0.5%冰醋酸分色40 s，中性樹膠封固后使用光學顯微鏡(徠卡DMI3000B)觀察并采集照片。

2 結果與分析

2.1 籽粒發育過程中的形態變化

小麥籽粒發育初期表面呈乳白色，腹部中央臍部呈現淺綠色，內部含有乳白色漿狀物質。發育中期小麥籽粒因果皮中含有葉綠體而呈現綠色。隨著發育天數的增加，小麥籽粒體積由小變大，0～6 d體積變化明顯，其后逐漸變緩(圖1)。

A：背面；B：腹面。圖下方數字為小麥籽粒發育天數，標尺=1 mm。

2.2 蠟切片技術優化

根據傳統石蠟切片方法制作的小麥籽粒石蠟切片，浸蠟后籽粒變硬且呈現棕黃色，切片時出現粉末且蠟帶中間有孔洞，或者可切片但厚度在15 μm以上，切片效果不理想。試驗方法改進過程中發現脫水、透明和浸蠟環節對切片質量影響較大，經過不斷摸索對梯度脫水時間、透明和浸蠟程序進行了優化。

2.2.1 脫水和透明程序的優化

制片過程中若組織內的水分不能除盡，就會影響后續的透明和浸蠟。發育早期小麥籽粒在固定后，腹側仍呈現較淺的綠色，與其他組織相比，較易判斷脫水的效果。根據設計對70%乙醇和100%乙醇時間進行了優化，發現僅增加70%乙醇處理時間，籽粒綠色不能完全褪去，增加無水乙醇處理時間后，脫水效果較好，綠色褪去，呈現淡黃色。

使用傳統方法透明時有的籽粒沒有明顯變化(圖2A)，有的籽粒明顯皺縮(圖2C)，透明程序結束后籽粒顏色均加深，多呈深黃色(圖2B、D)。使用改良的乙醇二甲苯逐級透明方案時，籽粒在透明過程中沒有明顯變化(圖2E)，直至透明結束籽粒仍飽滿，呈現更加明顯的乳白色或者淡黃色(圖2F)。故較優透明程序為乙醇二甲苯逐級透明法，即無水乙醇∶二甲苯=3∶1→無水乙醇∶二甲苯=2∶1→無水乙醇∶二甲苯=1∶1→純二甲苯，各1 h。

A、C：傳統方法透明中籽粒形態；B、D：傳統方法透明后籽粒形態；E：改進方法透明中籽粒形態；F：改進方法透明后籽粒形態。

對經過不同脫水時間處理的小麥籽粒均進行乙醇二甲苯逐級透明，當前期脫水不充分，在透明過程中籽粒多出現局部皺縮(圖3A、C、E)，有些籽粒雖仍然飽滿但顏色加深(圖3 B、G、I)。當前期小麥籽粒脫水充分后，透明后籽粒均飽滿且呈現淡黃色(圖3D、F、H、J)，且70%乙醇脫水2 h以上結果差異不明顯，故確定最佳70%脫水時間為2 h，最佳無水乙醇脫水時間為4 ℃10 h。確定最佳脫水方案為：30%乙醇、1 h→50%乙醇、1 h→70%乙醇、2 h→85%乙醇、1 h→90%乙醇、1 h→95%乙醇、1 h→無水乙醇、4 ℃10 h。

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J：不同脫水處理后使用改進方法透明的籽粒形態。

2.2.2 充分浸蠟可以保證切片時組織的完整性

小麥籽粒浸蠟是否充分與處理時間和溫度都有關。結果(表2)顯示，直接使用高溫浸蠟(程序1)，籽粒明顯皺縮，顏色加深呈深黃色或黃褐色(圖4A、B)，切片時蠟帶中間有明顯孔洞，且有粉末掉落，不能夠完整切片(圖5A、C)。當使用逐級浸蠟程序2時，籽粒在浸蠟過程中仍然飽滿，顏色呈淡黃色(圖4C、D)，直至包埋后仍無明顯改變，可以完整切片(圖5B、D)。當縮短處理時間，使用程序3時，切片效果與程序2無差異，且節約了時間。故最佳浸蠟程序為逐級浸蠟，即二甲 苯∶石蠟=3∶1、37 ℃，直至溶解；二甲苯∶石 蠟=2∶1，42 ℃，直至溶解；二甲苯∶石蠟= 1∶1， 47 ℃，直至溶解；純石蠟，60 ℃，18 h。

A、B：傳統方法浸蠟后籽粒形態；C、D：改進方法浸蠟后籽粒形態。

A：傳統浸蠟方法處理后包埋籽粒(橫切面)；B：改進浸蠟方法處理后包埋籽粒(橫切面)；C：傳統浸蠟方法處理后切片蠟帶(孔洞， 粉末)；D：改進浸蠟方法處理后切片蠟帶(籽粒橫切面)。

2.3 小麥籽粒顯微結構觀察

2.3.1 小麥籽粒橫切面觀察

應用改進的方法可以切出連續的蠟帶，制作完整的籽粒橫切片。由小麥籽粒橫切面顯微結構可見，授粉后第0～6天的籽粒，外圍是厚厚的果皮，果皮厚度約占籽粒橫徑的一半，在籽粒腹部果皮的正中央有明顯的凹陷(圖6A、圖7A、圖8A、圖9A)。隨著灌漿物質的積累，小麥籽粒逐漸發育成熟，授粉后第8天的籽粒橫切面顯示，籽粒腹部的凹陷充實膨脹，胚乳細胞也明顯充實，籽粒橫切面由倒心形充實為接近圓形(圖10A)。隨著灌漿物質的繼續積累，小麥籽粒逐漸發育成熟，授粉后第10～14天的籽粒橫切面顯示，籽粒果皮進一步退化，中央胚乳部分繼續充實膨脹，與授粉后前6 d的籽粒相比，胚乳所占比例大大增加，外面僅有很薄的果皮包被，果皮厚度和細胞層數明顯減小(圖11A、圖12A、圖13A)。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內果皮(A中黑框D高倍觀)；Pe：果皮；CV：中央液泡；SG：淀粉粒；Nu：細胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內果皮(A中黑框D高倍觀)；Pe：果皮；CV：中央液泡；SG：淀粉粒；Nu：細胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內果皮(A中黑框D高倍觀)；E：外周胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內果皮(A中黑框D高倍觀)；E：外周胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內果皮(A中黑框D高倍觀)；E：外周近糊粉層胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：外周近中心胚乳(A中黑框F高倍觀)；G：中央近腹部胚乳(A中黑框G高倍觀)；H：中央近中心胚乳(A中黑框H高倍觀)；I：中央近背部胚乳(A中黑框I高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：果皮(A中黑框B高倍觀)；C：外周近糊粉層胚乳(A中黑框C高倍觀)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍觀)；E：中央胚乳腹部(A中黑框E高倍觀)；F：中央胚乳背部(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：果皮(A中黑框B高倍觀)；C：外周近糊粉層胚乳(A中黑框C高倍觀)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍觀)；E：中央近腹部胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央近背部胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：果皮(A中黑框B高倍觀)；C：外周近糊粉層胚乳(A中黑框C高倍觀)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍觀)；E：中央近腹部胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央近背部胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒。

2.3.2 果皮顯微結構觀察

小麥果皮由子房壁發育而來，外果皮細胞1～2層，呈方形或長方形；中果皮細胞數量較多，呈多邊形；內果皮靠近胚乳，由靠外側體積較大的橫細胞和1層排列規則的管細胞組成。授粉當天，果皮三層結構完整，開始出現較少量淀粉粒，中果皮中淀粉粒積累相對較多較少(圖6B～D)。授粉后第2天，果皮中淀粉粒呈圓形，體積較小，在果皮三層結構中沒有明顯差異(圖7B～D)。授粉后第4 8天，可以清楚看到中果皮薄壁細胞內積蓄的淀粉粒數量明顯增多，體積明顯變大，內果皮中次之，外果皮中淀粉粒最少(圖8B D、圖9B D、圖10B D)。授粉后第10～14天，小麥籽粒橫切面果皮顯著變薄，最薄處僅由4～5層細胞構成，而且果皮中積蓄的淀粉粒數量逐漸減少，體積也變小(圖11B、圖12B、圖13B)。

2.3.3 胚乳顯微結構觀察

小麥授粉后第0～2天的籽粒中央為一個大液泡，胚乳處于游離核階段，無淀粉粒積蓄。授粉后第4天，胚乳細胞開始形成細胞壁，細胞網狀輪廓清晰可見，尚未積蓄淀粉粒(圖8E、F)。授粉后第6天，胚乳繼續進行細胞分化，開始積蓄少量淀粉粒(圖9E、F)。隨著時間的推移，授粉后第8天，胚乳細胞層數增加并趨向充滿胚囊，腹部胚乳細胞、背部中心和糊粉傳遞細胞中已有淀粉粒累積，此時淀粉粒呈圓球形，體積仍較小，而背部近糊粉層胚乳細胞仍具有較多胚乳核，未出現淀粉粒(圖10E～I)。授粉后第10～12天，小麥籽粒腹部胚乳細胞逐漸被淀粉粒充滿，淀粉粒體積逐漸增大，數量逐漸增多，背部胚乳繼續向無核化發展(圖11C～F、圖12C～F)。授粉后第14天，胚乳細胞中幾乎完全充滿淀粉粒，淀粉粒體積明顯增大，多為橢圓形和球形(圖13C～F)。

3 討 論

3.1 糯小麥果皮和胚乳淀粉積累特征

隨著小麥籽粒發育成熟，果皮發育與胚乳發育相協調。Xiong等研究認為，授粉后第3天果皮中開始積累淀粉體，授粉后第7～9天果皮內淀粉體增至最多，隨后開始消失。Zheng等發現，小麥穎果授粉后第3天果皮厚，授粉后第6天果皮薄壁細胞明顯退化。劉大同等觀察發現，授粉后第5天果皮中淀粉粒較豐富，授粉后第10天果皮中淀粉粒數量增多、體積增大，隨后逐漸解體。本試驗也有類似結果，紫糯小麥授粉當天到第14天，果皮具有明顯的生長和消亡過程，果皮內淀粉粒也隨之累積和降解。授粉當天到第4天的小麥籽粒，主要是果皮中逐漸積蓄淀粉粒，這可能與籽粒發育初期營養供給有關。授粉后第6～8天，小麥籽粒果皮中淀粉粒蓄積最多，且淀粉粒在內、中、外三層果皮中體積和數量分布呈現明顯差異，該階段果皮中淀粉粒增至最多，與胚乳細胞開始發生增殖和分化的時期基本一致，這可能與胚乳發育初期營養物質提供相關。授粉后第10天開始淀粉粒逐漸降解，被分解為營養物質，以供胚乳細胞充分吸收和利用。

小麥籽粒的生長發育伴隨著胚乳發育和淀粉積累。研究表明，在授粉后第5～6天時，小麥籽粒胚乳淀粉體首先在靠近細胞核的區域出現，授粉后第8～24天逐漸發育和富集。Jing等發現，普通小麥授粉后第4天開始出現少量淀粉粒，胚乳細胞化過程在授粉后第3天、4天開始，且由外向內進行，直至完全充滿。余徐潤等研究發現，小麥近糊粉層胚乳細胞比中央胚乳細胞內的淀粉粒體積小且數量少。本試驗中，小麥籽粒發育早期胚乳細胞的分化與淀粉粒的積蓄也遵循同樣的規律，授粉后第6天，胚乳細胞開始分化，出現極少量淀粉粒。授粉后第8～12天，胚乳繼續向無核化發展，淀粉粒積累在胚乳橫切面上呈現明顯差異，相對于近糊粉層細胞，中心細胞積累較快，淀粉粒充實度更好；腹部胚乳細胞較背部細胞積累多，背部糊粉傳遞細胞比近糊粉層細胞積蓄更快。授粉后第14天，淀粉粒積蓄已接近飽和，說明授粉后第8～14天淀粉粒積累迅速，是胚乳發育和淀粉粒形成的重要時期。Xiong等觀察發現，授粉后第15天小麥胚乳淀粉體數量分布呈顯著差異，腹部近糊粉層胚乳細胞比中心細胞內淀粉體數量多，背部中心胚乳細胞中淀粉體數量多于糊粉傳遞細胞。與之不同，本試驗發現，授粉后第8～14天小麥背部糊粉傳遞細胞內淀粉粒積累比近糊粉層胚乳細胞更多、更快，這可能與小麥胚乳淀粉積累時序存在品種差異 有關。

3.2 石蠟切片技術的優化

材料脫水、透明和浸蠟環節是影響切片質量的重要因素。康海岐等研究發現，質量分數為70%、83%、95%濃度梯度材料容易脫水且不易收縮。于曉剛等發現，將脫水步驟改為70%過夜、85%、95%、100%(每次2 h)及100%(1.5 h)乙醇溶液，組織材料不易變形且有利于脫水。張潤琪等采用酒精氯仿逐級混合透明，透明總用時達81 h；逐漸升溫浸蠟，但是前21 d的小麥籽粒浸蠟總時間長達84 h，切片厚度為10～25 μm。本試驗初期在常規石蠟切片技術基礎上，借鑒前述方法，制作了小麥籽粒石蠟切片，發現制作的授粉后第4天、第6天、第8天小麥籽粒的切片效果相對較好，但是授粉當天和授粉后第2天的小麥籽粒有皺縮現象，授粉后第10天后的小麥籽粒后續環節中顏色加深，無法制出10 μm的切片。后期試驗進行了改進，乙醇梯度脫水從30%濃度開始，70%乙醇脫水時間為2 h，100%乙醇步驟為 4 ℃脫水10 h，這樣降低了高濃度脫水對材料的影響，也增強了脫水效果。結果表明，授粉后第14天之前的小麥籽粒均可充分脫水，且不變形。透明環節改為乙醇和二甲苯逐級透明(無水乙醇 二甲苯=3∶1→無水乙醇∶二甲苯=2∶1→無水乙醇∶二甲苯=1∶1→純二甲苯，各1 h)，籽粒明顯不皺縮不變顏色。浸蠟方法改為從37 ℃開始逐級浸蠟，先是在純二甲苯中加入少量碎蠟粒，然后逐漸增加石蠟，同時逐漸升高溫度，效果改善明顯。該優化技術在其它小麥品種石蠟切片中也進行了應用，表現出明顯的改良效果(數據未顯示)，表明改進的石蠟切片制作方法適合于早期小麥籽粒的結構研究。