鐵皮石斛和CIK細胞對非小細胞肺癌患者術后外周血循環腫瘤細胞、細胞免疫功能和預后的影響

金從國，段林燦，沈紅梅，陳曉群，李佳，申昕鷺

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是所有肺癌中最常見的組織學類型，其5年生存率僅16%[1]。手術是其首選治療方案，但術后仍可發生腫瘤復發和轉移[2]，術后采取有效的內科治療尤為重要。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells，CIK)是癌癥免疫治療的理想候選細胞類型，可在體外誘導大量具有腫瘤殺傷作用的外周血單個核細胞，具有較強的抗腫瘤活性[3]。鐵皮石斛是一種天然的名貴中藥，具有抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能等作用，還可調控癌細胞周期抑制癌細胞增殖，促使其凋亡，并能抑制新生血管生成，發揮抗腫瘤作用[4]。鑒于此，現觀察鐵皮石斛聯合CIK應用于NSCLC患者術后治療及其對外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)、細胞免疫功能和預后的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月—2018年6月云南省腫瘤醫院收治的NSCLC患者360例，采用隨機、雙盲、平行對照方法分為觀察組和對照組。最終350例完成治療，對照組175例，觀察組175例。2組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、家族遺傳史、基礎病、術后治療方式、TNM分期、病理類型、腫瘤大小、KPS評分比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究獲得醫院倫理委員會批準(201601025)，患者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①均行肺癌根治手術治療，術后組織病理學證實為NSCLC；②術后除常規放化療外未行其他抗腫瘤治療；③KPS評分≥60分，預計生存期大于12個月；④中性粒細胞計數≥1.5×109/L，血小板計數≥100×109/L；⑤依從性較好。(2)排除標準：①其他類型肺癌或合并其他部位惡性腫瘤；②嚴重心、肺、肝、腎疾病，自身免疫性疾病，不可控制的活動性感染；③妊娠或哺乳期女性；④對本研究所選治療藥物過敏或治療禁忌。(3)剔除標準：①未遵醫囑按時按量服用鐵皮石斛者；②CIK治療不足4個療程退出者；③不配合復診，隨訪失聯者。

表1 對照組及觀察組臨床資料比較

1.3 治療方法 對照組：采用CIK治療，CIK細胞制備：采集患者外周血約50 ml加入肝素抗凝試管，分離外周血中單個核細胞(PBMC)置于Roswell Park Memorial Institute-1640培養基(美國賽默飛公司)，調整細胞密度在1×106/ml左右，加入γ-IFN 1 000 U/ml，在37℃、5%CO2培養箱(德國賓德公司)中培養24 h，加入IL-2(美國RD公司)300 U/ml、CD3McAb(美國RD公司)50 ng/ml，每隔3～4 d更換1次培養基，補加IL-2 300 U/ml，培養6 d左右采集CIK細胞。CIK細胞回輸：隨機采集少量CIK細胞，DxFlEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測CD3+CD56+T細胞比例≥50%，CD3+CD8+T細胞比例≥30%，且微生物檢測陰性時，生理鹽水洗滌CIK細胞3次，將其加入含20%人血白蛋白(瑞士杰特貝林生物制品有限公司，規格20%/50 ml)和生理鹽水共100 ml液體中靜脈回輸，每次回輸細胞數(2～6)×109/ml，1次/d，連續5 d為1個療程。觀察組：在對照組基礎上服用鐵皮石斛(東源石斛公司)，打碎成粉狀，取100 g泡入茶水中口服，3次/d，連續服用1個月為1個療程。2組2療程中間間隔2個月，均治療4個療程。

1.4 觀察指標與方法 分別于治療前，第一、二、三、四療程后采集患者外周靜脈血2 ml注入肝素抗凝試管混勻，采用DxFlEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測以下細胞。

1.4.1 外周血循環腫瘤細胞(CTC)檢測：取肝素抗凝的全血200 μl，加入 CD45-PC5(購自美國貝克曼庫爾特公司)20 μl、 EpCAM-PE(購自美國BD公司)20 μl和 CK18-FITC(購自英國ABCAM公司)20 μl混勻后避光靜置30 min，加入氯化銨2 ml溶血15 min，CD45-EpCAM+CK18+細胞計數，即CTC計數。

1.4.2 外周血T細胞亞群檢測：取肝素抗凝的全血100 μl，加入 CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5(購自美國BD公司)10 μl混勻避光室溫靜置30 min，加入氯化銨2 ml溶血15 min，DxFlEX流式細胞儀檢測CD3+細胞(CD45+CD3+細胞)、CD4+細胞(CD45+CD3+CD4+細胞)、CD8+細胞(CD45+CD3+CD8+細胞)。

1.4.3 自然殺傷(NK)細胞、CIK細胞檢測：取肝素抗凝的全血100 μl，加入 CD45-PC5 20 μl、CD3-FITC/CD16+56-PE(購自美國貝克曼庫爾特公司)混勻避光室溫靜置30 min，加入氯化銨2 ml溶血15 min，DxFlEX流式細胞儀檢測NK細胞(CD45+CD3-CD16+56+細胞)，CIK細胞(CD45+CD3+CD16+56+細胞)。

1.4.4 不良反應：記錄治療期間患者體溫升高、興奮、失眠、頭暈、惡心、中毒、過敏等不良反應。

1.4.5 隨訪情況：所有患者均定期復診和接受電話隨訪，隨訪截止時間為2021年6月。統計隨訪期間腫瘤復發轉移情況。無疾病進展生存時間定義為病理確診至腫瘤復發、轉移的時間，總生存時間定義為病理確診至因任何原因導致死亡的時間或隨訪截止時間。

2 結 果

2.1 2組外周血CTC水平比較 治療前、第一療程后，2組外周血CTC計數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療第二、三、四療程后，隨療程延長2組外周血CTC計數均逐漸降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.2 2組外周血T細胞亞群比較 治療前、第一療程后2組外周血CD3+細胞占比、CD4+細胞占比、CD4+/ CD8+比值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療第二、三、四療程后，隨療程延長2組外周血CD3+細胞占比、CD4+細胞占比、CD4+/ CD8+比值均逐漸增加，且觀察組高于對照組(P<0.05)。但2組治療前后CD8+細胞占比比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 2組外周血NK細胞、CIK細胞比較 治療前、第一療程后2組外周血NK細胞占比、CIK細胞占比比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療第二、三、四療程后，隨療程延長2組外周血NK細胞占比、CIK細胞占比均逐漸升高，且觀察組高于對照組(P<0.05),見表4。

2.4 2組不良反應比較 2組治療期間均未出現中毒、過敏病例。對照組出現體溫升高2例，失眠1例，頭暈2例，不良反應發生率2.86%；觀察組出現體溫升高1例，惡心1例，不良反應發生率1.14%。2組均未行特殊治療，停藥后好轉。2組不良反應發生率比較差異無統計學意義(χ2=1.502，P=0.220)。

2.5 2組生存情況比較 隨訪截止時間為2021年6月，中位隨訪時間48(36～60)個月。350例患者隨訪失聯12例，隨訪期間復發10例，轉移32例，死亡253例，最終無疾病進展生存43例，總生存85例。觀察組總生存率、無疾病進展生存率均高于對照組(χ2/P=9.667/0.002，13.820/<0.001)，見表5、圖1。

表2 對照組及觀察組患者外周血CTC計數比較個)

表4 對照組及觀察組患者外周血NK細胞、CIK細胞比較

3 討 論

CTC是脫離實體病變瘤進入外周血循環的癌細胞，負責癌細胞的轉移擴散，與腫瘤隱性微轉移密切相關，是遠處轉移的前提和關鍵環節。越來越多研究發現，不論是治療前，還是切除原發病灶后，亦或復發腫瘤患者體內均可檢測到不同水平的CTC[5]。外周血CTC檢測被認為是液體活檢的一部分，屬于相對無創且容易獲得的癌組織樣本，可反映肺癌實際狀態，故常被用于指導NSCLC臨床治療及評估NSCLC術后復發風險[6-8]。免疫細胞介導先天免疫反應和誘導適應性免疫反應，是機體抗腫瘤免疫的重要機制，CD4+T 細胞分泌的干擾素-γ，腫瘤抗原特異性 IgG具有重要的清除腫瘤的功能[9]。NK細胞是先天免疫系統的主要細胞毒性效應細胞，占循環淋巴細胞的5%～15%，可裂解腫瘤細胞，具有增強腫瘤細胞殺傷的作用[10]。樹突狀細胞是最有效的抗原呈遞細胞，能激活幼稚細胞和記憶免疫反應，基于樹突狀細胞的細胞免疫療法可增強抗腫瘤免疫力[11]。CIK是效應CD3+CD56-、CD3-CD56+和CD3+CD56+自然殺傷 T 細胞的異質群體，自外周血單個核細胞體外擴增，對腫瘤靶標具有廣泛而較強的溶細胞活性[12]。

圖1 對照組和觀察組NSCLC患者無疾病進展和總生存曲線比較

表3 對照組及觀察組患者外周血T細胞亞群比較

表5 對照組及觀察組患者生存情況比較 [例(%)]

本結果表明，鐵皮石斛、CIK治療后均可抑制外周血CTC水平，增強細胞免疫功能，提高機體抗腫瘤能力，而鐵皮石斛聯合CIK治療可更有效地提高機體細胞免疫功能，降低CTC水平，對抑制腫瘤細胞復發轉移可能有益。CIK細胞具有T淋巴細胞抗瘤活性及NK細胞非MHC限制性殺傷腫瘤細胞的特點，不影響機體免疫功能，直接殺傷腫瘤細胞，增加機體免疫功能，被認為是腫瘤過繼細胞免疫治療的首選，CIK在腫瘤免疫治療中也得到廣泛的應用，取得了顯著的效果[13-14]。鐵皮石斛是我國傳統中藥材，其主要成分為鐵皮石斛多糖，可抑制超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽過氧化物酶水平，發揮抗氧化作用，還可上調Bax和下調抗凋亡B細胞淋巴瘤2、表皮生長因子、表皮生長因子受體等抑制癌細胞增殖，促使癌細胞凋亡[15]。鐵皮石斛中天然黃酮苷對癌癥治療也有重要價值，體外研究顯示，鐵皮石斛天然黃酮苷ViceninⅡ可抑制轉化生長因子-β/Smad和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，促使其失活，進而抑制轉化生長因子-β1誘導的肺腺癌上皮間質轉化過程[16]。除抗氧化、抗腫瘤作用之外，鐵皮石斛還具有免疫調節作用，其成分2,3-O-乙酰化-1,4-β-d-葡甘露聚糖可通過Toll樣受體4和髓樣分化因子88信號通路激活核因子-κB，調節免疫炎性反應，增強機體免疫功能[17-18]。因此，鐵皮石斛和CIK治療更有助于增強NSCLC患者術后免疫功能，清除循環血中殘余腫瘤細胞。

從隨訪結果可以看出，鐵皮石斛和CIK聯合治療對延長肺癌患者術后生存有益，這與其增強細胞免疫功能，提高抗腫瘤反應有關。鐵皮石斛無明顯不良反應，目前鮮有報道服用鐵皮石斛帶來的不良反應，本研究觀察組治療期間亦未發生嚴重不良反應，僅出現CIK治療相關的體溫升高、興奮失眠等癥狀，總不良反應發生率與對照組無差異，說明增加鐵皮石斛治療并不增加不良反應風險，具有較高的安全性。

綜上，NSCLC患者術后通過鐵皮石斛聯合CIK治療可明顯降低外周血CTC水平，增強細胞免疫功能，有助于預防腫瘤復發和轉移，延長患者生存時間，優于單獨CIK治療。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

金從國：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；段林燦：提出研究思路，分析試驗數據；沈紅梅：論文審核;陳曉群：資料搜集整理，論文修改;李佳：進行統計學分析;申昕鷺：課題設計