皮膚鱗狀細(xì)胞癌中miR-383-5p、KIF3B mRNA的表達(dá)及臨床意義

黃永初，張小超，朱小美，詹娟

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)是一種常見的非黑素瘤皮膚癌，占所有皮膚癌的20%～50%，是非黑素瘤皮膚癌患者死亡的主要原因[1]。 腫瘤是由多因素、多基因介導(dǎo)的過程，微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼小RNA，能通過結(jié)合目標(biāo)RNA互補(bǔ)片段，調(diào)控癌基因與抑癌基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[2]。研究報(bào)道，miR-383-5p在乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等行為[3-4]。細(xì)胞異常分裂是腫瘤發(fā)生重要原因之一，驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員3B(kinesin family member 3B，KIF3B)為細(xì)胞分裂驅(qū)動(dòng)蛋白家族一員，其過度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞異常分裂，研究報(bào)道，KIF3B參與胃癌、骨肉瘤等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[5-6]。目前尚不明確miR-383-5p、KIF3B與cSCC的關(guān)系，本研究旨在分析cSCC癌組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系，以期為cSCC診斷和治療提供一種新的策略，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2021年8月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科收治手術(shù)切除cSCC患者49例，其中男26例，女23例，年齡42～82(60.25±8.66)歲；發(fā)病部位：頭面部41例，肢體4例，軀干4例；皮損直徑：≥5 cm 9例，<5 cm 40例；分化程度：低分化17例，中高分化32例；TNM分期[7]：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期14例；侵襲程度：淺表20例，深部29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為cSCC；②初次確診，術(shù)前未接受任何內(nèi)分泌、放化療者；③臨床資料完整者；④可接受隨訪者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤者；②嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病者；③全身感染性疾病者；④妊娠期及哺乳期女性。

1.3 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)檢測 手術(shù)切除癌組織和癌旁組織(距離癌組織>5 cm)，剪碎后研磨，使用TRIzol總RNA抽提試劑盒提取組織中總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA純度，使OD260/OD280為1.8～2.0，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。miR-383-5p上游引物：5′-TCGGTGTTAGTGGAAGACTAGAC-3′，下游引物：5′-GTCTAGTCTTCCACTAACACCGA-3′；KIF3B上游引物：5′-GATGTTAAGCTGGGGCAGGT-3′，下游引物：5′-TTTGCCGTCCACTAGAGCAG-3′；miR-383-5p內(nèi)參U6上游引物：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物：5′-AATATGGAACGCTTCACGAAT-3′；KIF3B內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應(yīng)體系(共10.0 μl)：SYBR Premix Ex Taq 5.0 μl,引物0.2 μl, ROX Reference Dye 0.2 μl, cDNA模板1.0 μl, RNase-free ddH2O 3.4 μl。反應(yīng)條件：95℃ 90 s (1個(gè)循環(huán))，95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(40個(gè)循環(huán))，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 cSCC癌組織和癌旁組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)比較 cSCC癌組織中miR-383-5p表達(dá)明顯低于癌旁組織，KIF3B mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.01)，見表1。

表1 cSCC癌組織和癌旁組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)比較

2.2 cSCC組織中miR-383-5p與KIF3B mRNA表達(dá)的相關(guān)性 http://starbase.sysu.edu.cn/網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，KIF3B的3' -非翻譯區(qū)659～665堿基處存在與miR-383-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。Pearson相關(guān)性分析顯示，cSCC組織中miR-383-5p與KIF3B mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.573，P<0.001)。

2.3 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)在cSCC患者不同臨床/病理參數(shù)中比較 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)在cSCC患者不同TNM分期、侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在不同性別、年齡、發(fā)病部位、皮損直徑、分化程度方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見表2。

圖1 miR-383-5p與KIF3B結(jié)合位點(diǎn)示意圖

2.4 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)對(duì)cSCC發(fā)生的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線顯示，miR-383-5p聯(lián)合KIF3B mRNA預(yù)測cSCC發(fā)生的AUC大于二者單獨(dú)預(yù)測(Z=2.936、3.220，P=0.003、0.001)，見表3、圖2。

3 討 論

cSCC是起源于附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞或表皮的惡性增殖性腫瘤，通常發(fā)生于陽光照射區(qū)域，以頭頸部較常見，目前cSCC的治療仍然以完全切除原發(fā)腫瘤為主，大多cSCC在手術(shù)切除后可以成功根除，但14%～15%的原發(fā)性cSCC患者存在亞臨床浸潤[8]。cSCC具備較強(qiáng)侵襲性，腫瘤細(xì)胞浸潤性生長可突破表皮基底膜，侵犯真皮深部、皮膚附屬器、血管、淋巴管、神經(jīng)等，發(fā)展為高危型cSCC，雖然近年來Mohs顯微描記手術(shù)和西米普利單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗等免疫和靶向治療藥物極大地改善了cSCC患者預(yù)后，但高危和極高危型cSCC預(yù)后仍然較差，5年復(fù)發(fā)率為30%～50%[9]。因此有必要進(jìn)一步探索cSCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，識(shí)別更多治療靶點(diǎn)。

圖2 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)預(yù)測cSCC發(fā)生的ROC曲線

表2 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)與cSCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)對(duì)cSCC發(fā)生的預(yù)測價(jià)值

miRNA是一類內(nèi)源性長18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，能通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合，負(fù)反饋調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，在包括cSCC在內(nèi)多種腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能[10]。如miR-451a能通過3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1介導(dǎo)的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路抑制cSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。miR-383-5p定位于人染色體8p22，近年多項(xiàng)研究均報(bào)道了其與惡性腫瘤的關(guān)系。Azarbarzin等[12]研究報(bào)道，miR-383-5p在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，能通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)信號(hào)通路抑制程序性死亡配體1，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)凋亡。Li等[13]研究報(bào)道，miR-383-5p在肝癌中表達(dá)下調(diào)，能靶向囊泡關(guān)聯(lián)膜蛋白2抑制肝癌細(xì)胞增殖和增強(qiáng)化療敏感性。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，cSCC癌組織中miR-383-5p表達(dá)降低，提示miR-383-5p低表達(dá)可能在cSCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，cSCC組織中miR-383-5p表達(dá)與患者TNM分期、侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明miR-383-5p低表達(dá)參與cSCC發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與miR-383-5p能靶向抑制RNA結(jié)合基序蛋白3(RNA-binding motif 3，RBM3)表達(dá)有關(guān)。RBM3是一種富含甘氨酸的核糖核蛋白復(fù)合物，參與RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯，能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路、抑制G2/M期細(xì)胞數(shù)量、改變mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)腫瘤中激酶活性、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)原癌基因[14]。Wang等[15]研究報(bào)道，miR-383-5p能靶向抑制RBM3表達(dá)，從而抑制頭部、頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和促進(jìn)凋亡。

有絲分裂是細(xì)胞分裂主要方式，細(xì)胞分裂是指活細(xì)胞增殖數(shù)目由1個(gè)細(xì)胞分裂為2個(gè)細(xì)胞的過程，細(xì)胞分裂時(shí)會(huì)復(fù)制自身DNA以確保子代細(xì)胞DNA完整，若分裂過程中復(fù)制不全或DNA損傷則會(huì)引起癌變[16]。細(xì)胞分裂是由多個(gè)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)蛋白調(diào)控通路構(gòu)成的復(fù)雜生命活動(dòng)，驅(qū)動(dòng)蛋白沿微管細(xì)絲的移動(dòng)支持有絲分裂、減數(shù)分裂和細(xì)胞運(yùn)輸?shù)榷喾N細(xì)胞功能[17]。KIF3B是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族一員，定位于人染色體20q11.21，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和增殖，有絲分裂期間KIF3B負(fù)責(zé)囊泡運(yùn)輸和膜擴(kuò)張，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移。近年來多項(xiàng)研究也報(bào)道了KIF3B與惡性腫瘤的關(guān)系，如KIF3B在乳腺癌、結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，沉默KIF3B能通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制乳腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，cSCC癌組織中KIF3B表達(dá)升高，并與cSCC患者TNM分期、侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明KIF3B高表達(dá)參與cSCC惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能為KIF3B過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常，促進(jìn)cSCC發(fā)生和惡性進(jìn)展。最后通過miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Starbase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-383-5p與KIF3B存在結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)性分析也顯示，cSCC癌組織中miR-383-5p與KIF3B mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明miR-383-5p、KIF3B可能共同參與cSCC發(fā)生發(fā)展。林永麗等[19]通過雙熒光素酶基因也證實(shí)cSCC中miR-383-5p能靶向負(fù)調(diào)控KIF3B表達(dá)，抑制cSCC細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果。本研究ROC曲線顯示，miR-383-5p、KIF3B mRNA均能作為cSCC發(fā)生預(yù)測指標(biāo)，且二者聯(lián)合預(yù)測cSCC發(fā)生的AUC大于單獨(dú)預(yù)測，說明聯(lián)合檢測miR-383-5p、KIF3B mRNA表達(dá)能提升cSCC發(fā)生預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，cSCC組織中miR-383-5p低表達(dá)，KIF3B mRNA高表達(dá)，與TNM分期、侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者可能共同參與cSCC發(fā)生發(fā)展，可作為cSCC發(fā)生預(yù)測指標(biāo)。但本研究樣本量較少，關(guān)于miR-383-5p、KIF3B對(duì)cSCC的影響機(jī)制尚不完全明確，同時(shí)因隨訪時(shí)間較短，關(guān)于miR-383-5p、KIF3B與cSCC患者生存率和預(yù)后的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃永初：課題設(shè)計(jì)，實(shí)施部分試驗(yàn)研究，論文修改和審核；張小超：實(shí)施部分試驗(yàn)研究，論文撰寫；朱小美：資料搜集整理，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)；詹娟：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析