環境檢測中微生物檢測的質量控制

＊胡關燕

（廣州市建筑材料工業研究所有限公司 廣東 510663）

1.微生物檢測技術概況

隨著科學技術水平的不斷進步，微生物檢測技術類別也越來越多。本文將微生物檢測技術大致分為四類：

（1）生化反應鑒定檢測技術。傳統的生化反應鑒定檢測技術鑒定結果準確可靠，但是相對耗時費力，檢測周期長。微型、簡便、快速、自動化監測技術應運而生，如顯色培養技術、免疫磁珠技術、手動或全自動細菌鑒定系統、微生物快速測試片、流式細胞儀、高通量測序檢測與篩查技術等[1]。

（2）免疫學檢測技術。免疫學檢測技術的靈敏度高，重復性強，成本低，但是制備抗體前處理麻煩。免疫學檢測技術又分類為放射免疫分析技術、酶聯免疫吸附測定技術、時間分辨熒光免疫分析技術、膠體金免疫層析技術、其他免疫學檢測技術。

（3）分析生物學檢測技術。分析生物學檢測技術又分類為PCR檢測技術、核酸等溫檢測技術、基因芯片檢測技術[2]、核酸分型檢測技術及其他核酸檢測技術。

（4）其他檢測技術。其他檢測技術有基于ATP的檢測技術、熒光標記細胞檢測技術、流式細胞檢測技術等。

微生物檢測技術適用范圍廣泛，涉及水質、食品、疾病預防控制、化妝品、藥品、建設工程材料、園林綠化、農產品、電子電氣、日用化工產品、金屬制品、陶瓷制品、嬰幼產品、水暖衛浴產品、輕紡產品、家具、機械設備、醫療器械、特種設備、化學品、固體廢物、土壤和沉積物等類別對象。其中，傳統的生化反應鑒定檢測技術占比最高，其次是PCR檢測技術、酶聯免疫吸附測定技術、核酸等溫檢測技術、熒光標記細胞檢測技術、手動或全自動細菌鑒定系統、微生物快速測試片、免疫磁珠技術、流式細胞儀等。

2.環境檢測領域中微生物檢測概況

目前，環境檢測領域中，涉及資質認定的微生物檢測類的檢測對象有水和廢水、海水、污水處理廠污泥、化學品、海洋沉積物等。各類檢測對象中所采用的常規檢測方法有：平板計數法、紙片法、多管法、濾膜法、酶底物法等。檢測方法為傳統生化反應鑒定檢測技術居多。

微生物檢測的實驗過程，相對化學檢測實驗來說差異性比較大，同樣相應的質量控制也有較大的差異。為了做好微生物檢測的質量控制，能更好地保障結果的有效性。本文將從人員、場所、儀器、物料、方法、管理體系這六大方面闡述環境檢測領域中常規微生物檢測的質量控制要點。

3.人員

鑒于微生物檢測的特殊性，實驗室應對相應的人員進行專門的培訓，培訓需結合所檢項目的技術與質量要求開展。

（1）采樣人員。采樣人員需要經過培訓，了解樣品采集需要做到的質量控制要點：微生物的樣品采集需安排優先采集或專用采集工具，避免采樣人員在樣品采集的過程中引起更多的交叉污染。采集所用的采樣裝置和容器，在使用前需要進行滅菌。采樣人員需要了解采樣現場的廢水處理工藝，判斷是否需要加入能去除活性氯的硫代硫酸鈉溶液等保存劑。微生物樣品對保存時間和保存溫度都有要求，采樣人員需要了解所采集項目的時效合理安排采樣任務。實驗室需配備足夠的保溫箱，實現分區域保存采集容器和樣品，從采樣到運輸都保證樣品不受污染。

（2）樣品管理員。送回實驗室的微生物樣品，樣品管理員需做到以下質量控制的基本要求：檢查樣品的保存條件和時效是否符合所檢項目的要求。需要把放置微生物檢測用的樣品存放區域和其他樣品存放區域區分開，以保證領樣前，樣品不受污染。需定期對存放微生物樣品的區域進行消毒和保存溫度的監控。

（3）分析人員、審核人員等應具備相關的培訓、工作經歷，了解微生物檢測分析方法的技術和質量控制要點，并能按照方法和實驗室的要求，把相應的質量控制活動落實執行。

4.場所

（1）消毒。實驗室的消毒，可以用紫外滅菌燈開啟30min；或者用75%乙醇溶液、新潔爾滅溶液、84消毒液等定期輪換擦拭[3]。

（2）驗收。目前，環境檢測領域，沒有專門針對微生物檢測實驗場所的消毒驗收要求、技術規范等。行業內普遍采用的是參照《醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法》GB/T 16294-2010等方法對消毒后的實驗場所進行無菌驗收測試。

（3）實驗室布局。實驗室的布局應減少和避免潛在的污染：建議使用彩鋼板作為功能區的隔板，地板宜選用PVC材質的材料，這些材質都相對比較容易清潔和消毒干凈；總體布局宜遵循“單方向工作流程”原則[4]。

（4）新風補給系統。無菌室為了維持無菌的環境，一般需要密閉性良好，不引入為經過處理的新風。微生物檢測的無菌室，一般采用新風補給系統來維持實驗室的新風補給，同時不會因新風補給而引入新的污染。

經研究表明，紫外消毒在低溫環境下進行空氣消毒時的有效消毒時間為30～60min[5]。因此微生物在無菌室進行紫外消毒時，把新風補給系統開啟，設定20℃以下溫度，消毒效果很有保障。

進入無菌室的新風是經過新風補給系統過濾消毒后帶入的，這樣才能保證：（1）新風補給沒有污染；（2）檢測分析人員能在無菌室長時間的操作，不會因缺乏新風而缺氧[6]。因此，在對消毒后的實驗場所進行無菌驗收測試時，需要在打開新風補給系統的情況下進行驗收測試的樣品采集。

5.儀器

微生物檢測需要的儀器設備大致有：滅菌消毒儀器、生物安全柜與超凈臺、恒溫培養儀器、生化分析儀器、基因檢測儀器、分子檢測儀器等。其中需要做的質量控制活動有：

（1）計量。對于檢測結果、生物安全等方面有重大影響的設備需要進行計量。如培養箱、生物安全柜等。設備經過計量后，需要對結果進行確認，保證設備的使用滿足標準，必要時需把校準因子用到檢測工作中。

（2）消毒。檢測人員應定期對恒溫培養儀器的內部箱體進行消毒，以保證箱體潔凈無菌，不會引起樣品或試劑的污染；對于無菌操作過程中的容器、玻儀等，也需要進行消毒處理。

對于滅菌消毒儀器，檢測人員應每次都監控其滅菌消毒效果。在《水和廢水監測分析方法（第四版）（增補版）》中，有對干熱、濕熱滅菌消毒儀器及紫外滅菌燈的質控要求。其中，需要干熱滅菌箱每日進行溫度穩定性的校驗；需要濕熱滅菌器每月進行滅菌效果的檢查；需要在每個季度檢查其紫外燈光強度或滅菌能力[7]。隨著市場的需求越來越大，市面上也有相應簡便的操作方式對滅菌效果進行檢查。如滅菌指示卡，紫外線強度指示卡、消毒變色膠帶等。

（3）維護。儀器的日常維護，是質量保證的重要措施之一。其中，新風系統的濾芯更換未能得到實驗室的關注和落實，這樣容易引起新風系統無法正常工作，從而影響無菌室的正常使用。另外，實驗室對儀器維護的性能驗證要求和頻率要求不是很清晰，如若檢測分析方法沒有要求，可以參考《實驗室質量控制規范食品微生物檢測》GB/T 27450-2008的附錄C（資料性附錄）設備的校準、維護和性能驗證[8]。

6.物料

微生物檢測中，相對需要重點關注的物料有：標準菌株、培養基和無菌水。此外，就是輔助工具物料也相應需要根據用途進行質量控制或輔助進行其他方面的質量控制。

（1）標準菌株。標準菌株是具有穩定的生物學特性并具有溯源性的。在微生物檢測過程中，標準菌株的作用有：①用于檢測方法的確認。②用于實驗過程的質量控制。③用于對培養基的性能驗證。④用于的相關試劑的性能要求。⑤用于對相關儀器設備的性能驗證。⑥用于對內部質控控制和外部質量評估[9]。其中，上述的①②⑥在環境檢測領域中較為常用。

其中，檢測分析人員對于標準菌株的質量控制需要注意以下幾個方面：

A.標準菌株的保藏方法和時效性。

B.標準菌株的傳代培養次數：標準菌株的傳代培養次數原則上是不得超過5次。其中，第一袋的活性相對于第二到第五代的活性較弱，建議傳代后從第二代開始冷凍保存更為適宜[4]。

C.原始的標準菌株傳代后應制備成儲備菌株和工作菌株，并做好確認試驗。保證菌株的有效性。

（2）培養基。培養基是可供微生物細胞生長繁殖和合成各種代謝產物的營養物質。

按培養基的物理狀態分類，培養基可分為液體培養基、半固體培養基、固體培養基三種。其中，液體培養基和固體培養基在環境檢測中的微生物檢測的使用頻次較大。

在微生物檢測中，培養基的作用是能為目標檢測物提供營養且盡可能少的產生影響檢測目標物的副產物。因此，培養基的驗收，是微生物檢測質量控制用的重要手段。在《水和廢水監測分析方法（第四版）（增補版）》中，對培養基的驗收，有以下要求[7]：

每批培養基在使用前需經無菌驗收。

用已知菌種檢查在此培養基上的生長繁殖情況或做陽性和陰性對照培養檢查試驗。

配置每批培養基均要做好記錄，登記配置日期、批次、培養基名稱、成分、pH、滅菌條件、配制方法及配制人等。

除第四版的要求外，還要考慮培養基的存放條件。隨著微生物檢測的需求越來越大，越來越多的檢驗檢測人員選擇商品化培養基，部分商品化培養基需要低溫保存，這也是對培養基的質量控制工作之一。

（3）無菌水。無菌水的制備：適量實驗用水，經121℃高壓蒸汽滅菌20min。對于無菌水的驗收，往往是每次試驗中進行實驗室空白測定來實現。

（4）輔助工具。為了更好地保障微生物無菌室不受污染，我們可以通過一些輔助工具或內務管理來實現質控控制：

鞋套：進入微生物室前套上經過消毒的鞋套，能更好地防塵和減少對外界細菌的接觸。

傳遞窗：傳遞窗是微生物實驗室布局的關鍵，它讓“單方向工作流程”原則在實際微生物檢測中能更好地實現。其中，需要特別注意的是，傳遞窗的紫外燈也需要定期進行監控其滅菌能力。但是，在目前對紫外燈消毒效果監測的方法中，基本要求測試儀器或指示卡需要在紫外燈下垂直距離1m處進行測定。由于傳遞窗結構的原因，無法實現，所以筆者建議參考《水和廢水監測分析方法（第四版）（增補版）》的方法，用生長有200～250個細菌菌落的瓊脂平皿暴露于紫外燈下2min，99%的菌數被殺滅[7]。

瓷珠保藏管：瓷珠保藏法是將培養好的微生物細胞或孢子制成懸浮液，轉入裝有無菌多孔玻璃珠（或瓷珠）的無菌瓶中，使其吸附于玻璃珠表面，去除多余懸浮液，低溫冷凍保存的一種菌種保藏方法。它適用于大多數微生物，如無芽孢的細菌或葡萄球菌以及噬菌體、放線菌、絲狀真菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌屬、霉菌等的保藏[10]。

其中瓷珠保藏法需要用到的工具就是瓷珠保藏管。通過瓷珠保藏管，我們可以把傳代過后的標準菌株的保存時間延長，減少標準菌株的購買成本同時可以保證有足夠數量的標準菌株配合質控控制活動的需要。

7.方法

對于同一個檢測項目，可以根據實驗室的條件，申請多方法的資質認定。如糞大腸菌群，可以申請《水質糞大腸菌群的測定多管發酵法》HJ 347.2-2018、《水質糞大腸菌群的測定濾膜法》HJ 347.1-2018、《水質總大腸菌群和糞大腸菌群的測定紙片快速法》HJ 755-2015、《水質總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》HJ 1001-2018等6種方法。方法的選擇會影響結果的準確性和質量控制所需的物料和手段。目前，在水（含大氣降水）和廢水的檢測對象中，比較常用的方法為多管發酵法、紙片快速法和酶底物法。

當實驗室申請了多個方法的時候，往往某些方法是比較常用，某些方法是不常用的。這個時候，實驗室需要對不常用的檢測方法進行持續能力的監督，以保證方法的適用性和檢測人員的檢測能力持續性。

8.管理體系

良好的實驗室管理體系運作情況應該是：輸出的依據來源于輸入，輸入的改進來源于輸出，且輸出和改進不斷持續。相對應的質控控制活動也是，需要有專門的技術人員對微生物檢測的質量控制活動進行文件性化的規定（即輸入），如把上述的質量控制要點、要求等編寫成作業指導書等技術文件或納入質量控制計劃：如微生物檢測實驗室的內務管理作業指導書、微生物檢測實驗室質量控制作業指導書、微生物檢測實驗室儀器、物理驗收與維護作業指導書等。通過科學的統籌內，把技術和質量要點融合，監督檢驗檢測人員的質量控制活動的實施情況。

9.結論

微生物檢測相對于化學檢測的差異性確實比較大，但是同樣可以從人員、場所、儀器、物料、方法、管理體系這六大方面逐一分析，做好質量控制工作，保障分析結果的有效性。