五種雙殼貝類貝殼微觀結構觀察與成分分析

莫天寶, 徐洪強, 何 京, 董迎輝, 林志華,

五種雙殼貝類貝殼微觀結構觀察與成分分析

莫天寶1, 2, 徐洪強3, 何 京3, 董迎輝2, 林志華2, 3

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306; 2. 浙江萬里學院 生物與環境學院 浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室, 浙江 寧波 315100; 3. 浙江萬里學院 寧海海洋生物種業研究院, 浙江 寧海 315604)

利用掃描電鏡技術、X-射線粉末衍射技術和弱酸去鈣法, 對菲律賓蛤仔、文蛤、厚殼貽貝、泥蚶、縊蟶5種習見海洋經濟貝類貝殼的斷面微觀結構、物相組成、有機基質和蛋白質含量等進行了觀察和分析。電鏡觀察結果顯示, 5種貝殼的微觀結構主要包含棱柱層和珍珠層; 棱柱層晶體結構有斜棱柱層、球棱柱層、棱柱層、均質層和交錯板狀層5種類型, 其中縊蟶只有斜棱柱層, 而泥蚶除球棱柱層外, 其他4種晶體類型均存在, 此復雜結構可能與其貝殼強度大有關; 珍珠層晶體結構有珍珠層和肌棱柱層2種類型, 其中厚殼貽貝的珍珠層呈典型的“磚-泥”結構, 具有明顯的層狀結構, 其余4種貝殼珍珠層均由不規則塊狀結構組成。X-射線衍射結果顯示, 菲律賓蛤仔、文蛤、縊蟶和泥蚶4種貝殼都屬于文石質殼體, 無機相幾乎由文石組成, 而厚殼貽貝屬于混合質殼體, 無機相由文石和方解石組成; 貝殼化學成分分析顯示, 5種貝殼有機質含量均為3%左右, 而總蛋白含量占有機質的2.98%～7.21%, 其中可溶性蛋白是不可溶蛋白含量的5.55～20.31倍。上述結果為貝殼形成機理的研究積累了基礎資料。

貝殼; 微觀結構; 有機質; 掃描電鏡; X-射線衍射

貝殼是一種天然的復合材料, 其優異的力學性能和良好的生物相容性歷來是生物材料和仿生學等領域的研究熱點之一[1-2], 而在水產領域中貝類殼色、殼型、殼厚度等性狀近年來也引起諸多研究者和育種學家的廣泛關注。在殼色方面, 國內學者相繼培育出櫛孔扇貝()“蓬萊紅”[3]、海灣扇貝()“中科紅”[4]、長牡蠣()“海大2號”和“海大3號”[5-6]、文蛤()“科浙1號”[7]和“萬里紅”[8]等優良新品種, 而這些殼色靚麗的新品種均能提高其經濟價值; 殼型方面, 培育有“殼寬型”菲律賓蛤仔()[9]、“深凹殼型”香港牡蠣()[10]、“殼寬型”美洲牡蠣()[11]等新品系, 更受產業和市場的青睞; 在殼厚度方面, 開展了三角帆蚌()[12]、馬氏珠母貝()[13-14]等貝殼珍珠層厚度和礦化機理相關研究, 而厚重堅硬的貝殼能更好地抵御敵害生物捕食、降低生產管理帶來的機械損傷[15-17]。上述性狀與貝殼的結構和成分有著密切關系, 但目前研究工作主要集中在腹足綱貝類[18-19]和雙殼綱褶紋冠蚌()[20]、三角帆蚌[21]、馬氏珠母貝[13]等育珠貝的貝殼微觀結構類型、有機質和無機質特征及貝殼蛋白質的分子組成等[1], 其中以珍珠層的相關研究最為經典[22], 而對雙殼綱其他貝類的貝殼結構和成分等的系統研究鮮有報道。

典型的雙殼貝類貝殼分為3層, 角質層、棱柱層和珍珠層[23], 不同貝類其貝殼微觀結構及層次排列特征不同, Carter等[24]對雙殼貝類的貝殼形態、微觀結構特征進行觀察和分類, 根據其表型形態和晶體結構差異, 分為肌棱柱層(myostracum)、斜棱柱層(fibrous prismatic)、復雜交叉狀層(complex crossed lamellar)、交叉板狀層 intersected crossed platy)、珍珠質層(nacre)、球棱柱層(spherulitic prismatic)、均質層(homogeneous)等7大類。但由于貝類種類、生長環境的不同, 造成貝殼結構、化學成分和性能上的差異很大[25-27]。貝殼主要成分包括95%的碳酸鈣質晶體和少量有機質(約占5%)[28]。碳酸鈣晶體構型主要有文石質、方解石和混合質3種形式, 其中文石的力學性能優于方解石, 但方解石的穩定性好, 在混合質殼體貝類(牡蠣、貽貝等)中, 位于外層的方解石能有效防止碳酸鈣溶解, 保護貝殼和適應復雜多變的水體環境[29]。另外, 貝殼的形成是一個有機相-無機相分子相互作用的過程[30], 有機質在貝殼的形成以及結構、性能方面起到至關重要的作用, 它通過控制晶體形成、晶體結構、物相轉換等影響貝殼的性能[31]。因此充分了解不同貝類貝殼的結構和成分組成能針對性地對貝殼性狀進行開發利用。

菲律賓蛤仔、文蛤、厚殼貽貝()、泥蚶()和縊蟶()均是東部沿海習見的海洋貝類, 具有重要的經濟價值。本實驗用掃描電鏡技術、X-射線粉末衍射技術和弱酸去鈣分析法對5種貝類貝殼的斷面微觀結構、物相組成、有機基質和蛋白質含量等進行了觀察和比較分析, 以期為深入研究貝殼的形成機理及貝殼性狀的開發利用積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 貝殼樣品處理

實驗用菲律賓蛤仔、縊蟶為1齡貝, 文蛤為2齡貝, 泥蚶為3齡貝, 均采自于浙江省寧波市海洋與漁業研究院科技創新基地的養殖池塘, 厚殼貽貝為2齡貝, 采自浙江舟山。各取成貝3粒, 解剖去除軟體部, 用5% NaOH溶液去除貝殼上附著的雜質, 并用去離子水清洗貝殼, 晾干備用。

1.2 貝殼結構的掃描電鏡觀察

選取貝殼中間部位制成0.5 cm×0.5 cm小塊(圖1), 斷面用去離子水清洗后, 置于超聲波清洗儀處理10 min以清潔斷面。利用日本日立公司SU8230型掃描電鏡觀察拍照。

1.3 貝殼成分的X射線分析

將貝殼置于105 ℃烘箱中恒溫烘干3 h后, 用小型粉碎機粉碎, 過0.15 mm篩, 得到待測樣品。采用德國布魯公司D8 Advance型多晶體X射線衍射儀進行檢測, 檢測條件為: CuKα輻射、波長0.154 nm、電壓40 kV、掃描范圍3°～60°、步長0.02°、步速0.2 s。采用絕熱法計算各種晶體類型的比例。

W=/[K(1/1+2/2+……I/K)][32]. (1)

用待測物質與純剛玉(αAl2O3)按重量比1∶1混合均勻, 測量兩者的衍射強度之比, 這個比值稱為這個物相的值。式中代表樣品中任一相,和分別指衍射強度和質量分數。

1.4 有機質提取和蛋白含量測定

將貝殼用小型粉碎機粉碎, 取樣品各5 g, 用6.5 mol/L的醋酸于冰浴條件下溶解, 溶解過程盡量避免CO2過快生成和溢出, 反應至完全無氣泡后終止。將混合物離心(4 000 r/min, 4 ℃, 10 min)后分別收集上清液和沉淀, 上清液裝入截留分子量為1 000 Da的透析袋透析, 每隔半天換水一次, 透析共計3 d, 整個透析過程溫度維持在4 ℃。收集已透析的樣品溶液, 經 0.22 μm微孔濾膜過濾后于–20 ℃至完全凍結, 冷凍干燥后收集樣品, 得到可溶有機質(soluble matrix, SM)。將離心后的沉淀用去離子水沖洗3次, 離心后冷凍干燥, 收集樣品得到不可溶有機質(insoluble matrix, IM)。稱重并計算可溶性有機質和不可溶性有機質的產率。將冷凍干燥后的上清和沉淀樣品溶解, 采用二喹啉甲酸蛋白質法測定蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 5種貝殼的微觀結構

菲律賓蛤仔、文蛤、厚殼貽貝、泥蚶、縊蟶5種貝殼的厚度分別為(1.03±0.08) mm、(1.36±0.14) mm、(1.15±0.09) mm、(2.64±0.18) mm、(0.28±0.04) mm, 均由角質層、棱柱層和珍珠層3層組成。

貝殼斷面結構掃描電鏡結果顯示, 5種貝殼中殼層[33]主要包括斜棱柱層、棱柱層和球棱柱層3類層次結構。斜棱柱層在菲律賓蛤仔、厚殼貽貝、縊蟶中均存在, 菲律賓蛤仔斜棱柱層位于角質層下方, 晶體呈柱狀且不同晶體長度有明顯的差異, 晶體排列方向朝向貝殼生長方向(圖1a); 厚殼貽貝斜棱柱層呈圓柱狀, 與菲律賓蛤仔斜棱柱層相比較規律有序, 晶體厚度約為1 μm, 長度不均, 最長從珍珠層到角質層, 隨貝殼大小變化, 晶體排列緊密(圖1g); 縊蟶斜棱柱層呈“M”字結構從左到右重復排列, 有圓形顆粒晶體依附在柱狀晶體上, 排列緊密厚實, 構成了大部分貝殼(圖1m)。棱柱層在文蛤、泥蚶中存在, 文蛤棱柱層表現為由垂直于貝殼表面的短柱狀晶體組成平行于貝殼表面的方塊狀晶體, 厚度約為0.3～0.4 μm(圖1d); 泥蚶棱柱層則表現為柱狀晶體緊密堆疊, 平行于貝殼表面, 晶體排列比文蛤更為緊密(圖1j)。球棱柱層只存在于菲律賓蛤仔中, 其結構由大小較均勻的小圓塊緊密組合而成, 排列緊密(圖1b)。另外, 在泥蚶的棱柱層下方分別存在有均質層和交錯板狀層。均質層表現為表面光亮并有不規則的晶體突起, 晶體密實, 整體質地均勻, 可觀察到晶體表面分布有絲狀有機物(圖1k); 交錯片狀層結構是由互相平行的文石晶體聚集而成, 首級片體與次級片體互相部分疊加, 首級片體長而且規則, 內部次級片體較短且不規則, 分布廣泛, 為貝殼中間層主要結構, 這種復雜交錯片狀排列方式可以增加貝殼的強度(圖1l)。

圖1 貝殼斷面微觀結構掃描電鏡圖

注: a—c: 菲律賓蛤仔的斜棱柱層、球棱柱層和珍珠層; d—f: 文蛤的棱柱層、肌棱柱層和珍珠層; g—i: 厚殼貽貝的斜棱柱層、肌棱柱層和珍珠層; j—l, o: 泥蚶的棱柱層、均質層、交錯板狀層、和珍珠層; m, n: 縊蟶的棱柱層和珍珠層

5種貝殼的珍珠層主要包括不規則狀、復雜交叉狀、“板磚”狀3種類型的層次結構(表1)。菲律賓蛤仔、文蛤、縊蟶珍珠層呈不規則結構, 表現為由密實的塊狀晶體鑲嵌而成, 縫隙有不規則的顆粒晶體填充, 晶體排列較緊密, 排列緊密程度由大到小為: 文蛤、縊蟶、菲律賓蛤仔, 同時觀察到塊狀晶體之間存在絲狀有機物連接(圖1c、f、n)。泥蚶珍珠層呈復雜交叉狀, 首級片體形狀不規則, 相鄰塊體中的板片主要在兩個相反的方向排列, 該結構層相對于交錯片狀結構而言, 有序性較小, 厚度約為22 μm(圖1o)。厚殼貽貝的珍珠層呈典型的“磚-泥”結構, 由許多整齊堆疊的片層構成, 具有明顯的層狀結構, 片層厚度約0.4～0.6 μm, 在片層結構之間存在絲狀有機物連接, 與前4種的珍珠層相比, 顯得更加有序規則(圖1i)。在5種貝類貝殼中, 發現文蛤和厚殼貽貝珍珠層中存在肌棱柱層, 文蛤肌棱柱層呈方柱狀結構, 包埋在珍珠層內并垂直貝殼表面, 厚度1～2 μm (圖1e)。厚殼貽貝肌棱柱層同樣包埋在珍珠層中, 呈垂直于貝殼表面的柱狀結構, 緊密排列形成厚度約為1 μm板片并平行于貝殼表面, 整個肌棱柱層結構如文蛤一樣, 晶體排列緊密并平行于貝殼表面(圖1h)。

表1 5種貝類貝殼斷面的微觀結構特征

2.2 貝殼的X-射線粉末衍射和物相組成

圖2是5種貝類貝殼粉末的XRD圖譜, 其中菲律賓蛤仔、文蛤、泥蚶、縊蟶的圖譜類似, 峰形尖銳、結晶度良好, 均在(111)、(021)、(012)、(200)、(112)、(221)、(202)等晶面出現了與標準文石碳酸鈣晶體(PDF#41-1475)基本吻合的特征衍射峰, 表明這4種貝殼的碳酸鈣晶體基本為文石晶體。厚殼貽貝圖譜在(104)、(110)、(113)、(202)等晶面與標準方解石碳酸鈣晶體(PDF#47-1743)的特征衍射峰基本吻合, 表明其貝殼碳酸鈣晶體主要以方解石晶型為主。

根據公式(1)計算得出, 菲律賓蛤仔貝殼無機相由98.9%文石和1.1%方解石組成, 文蛤、泥蚶貝殼無機相由100%文石組成, 縊蟶由98.6%文石和1.4%方解石組成, 而厚殼貽貝則由30.1%文石和69.9%的方解石組成(圖2, 表2)。

2.3 貝殼有機質及蛋白含量的比較

用酸作為脫鈣溶液來分離可溶有機質和不可溶有機質, 5種貝類貝殼樣品中提取的有機質產率見表3。菲律賓蛤仔、文蛤、厚殼貽貝、泥蚶、縊蟶的有機質含量分別為3.283%、3.429%、3.057%、2.461%、3.345%, 不可溶有機質含量較高。

圖2 五種貝殼的X射線粉末衍射圖

表2 五種貝類貝殼物相組成

通過二喹啉甲酸蛋白質法測定有機質中的蛋白質含量, 結果顯示, 菲律賓蛤仔、文蛤、厚殼貽貝、泥蚶、縊蟶貝殼有機質中蛋白質的相對含量分別為2.98%、3.543%、4.954%、7.21%、5.086%, 可溶性蛋白含量是不可溶蛋白含量的5.55～20.31倍(表3)。

表3 五種貝類貝殼有機質含量比較

3 討論

貝殼的微觀結構有著明顯的多樣性, 如同為簾蛤科(Veneridae)的菲律賓蛤仔和文蛤卻在貝殼中間層組成上存在較大差異, 菲律賓蛤仔的中間層為短柱狀的斜棱柱層和顆粒狀的球棱柱層, 斜棱柱層晶體排列朝向貝殼生長方向, 球棱柱平行于貝殼開口方向, 而文蛤的中間層為平行于開口方向的短柱狀棱柱層。這些差異主要表現在晶體的組成和排列結構兩個方面, 這與陳道海等[34]關于13種雙殼類貝殼的掃描電鏡觀察結果一致, 不同種雙殼貝類貝殼橫切面微觀結構均有一定的差異。厚殼貽貝[28]和綠貽貝()[2]均屬于貽貝科, 但二者貝殼斷面結構也存在明顯的差異, 厚殼貽貝斷面結構主要包含珍珠質層、肌棱柱層和斜棱柱層3種層次結構, 而綠貽貝僅包含珍珠質層和肌棱柱層2種, 不存在斜棱柱層。在池蝶蚌()[35]中, 貝殼及其珍珠的珍珠層表面出現螺旋狀紋理, 這在其他的淡水珍珠貝(如三角帆蚌)的貝殼及珍珠中極為少見。另外, 研究發現泥蚶貝殼斷面結構比菲律賓蛤仔、文蛤、縊蟶貝殼更為復雜, 包含棱柱層、均質層、交錯板狀層、斜棱柱層和珍珠層5種類型的層次結構, 與蝦夷扇貝()貝殼層次結構相似[36], 其復雜的層次結構可能賦予了貝殼更強的抗擊能力和抗磨損能力。

貝殼的無機相組成與生活環境及生活方式有關。文蛤、縊蟶、泥蚶、菲律賓蛤仔屬于埋棲型貝類, 生活在潮間帶灘涂或池塘的沙泥底質中, 殼體被底質覆蓋, 可以做短距離運動, 如文蛤具有隨著生長由中潮區向低潮區或潮下帶遷移的習性, 縊蟶可在洞穴內做升降運動等, 需要堅硬的貝殼來抵抗底質和周圍環境的摩擦力。相對堅硬的貝殼更利于抵抗周圍環境的摩檫力。Fan[29]指出, 處在泥沙之中, 周圍介質(主要指孔隙水)的理化變化相對平穩, 對殼體穩定性的要求相對降低, 從文石、方解石性質差別上分析, 文石更適合這樣的環境。且文石的硬度比方解石大, 所以4種埋棲貝類貝殼以文石質殼體為主。而厚殼貽貝是附著型貝類, 與扇貝的生活方式相同, 貝殼屬于混合質殼體。Fan[29]認為混合質殼既能節省殼體需要付出的生物能量, 又具有方解石質殼體的性能, 適應復雜的水體變化。另有研究表明[37], 柳珊瑚全軸亞目(Holaxonia)的基部和軸, 如果溫度在15 ℃以上全為方解石, 20 ℃以上則全是文石質, 在15～20 ℃之間為文石和方解石組成, 這也解釋了貝殼物相的組成與其生活環境、生活方式有關。

貝殼的形成是一個有機相-無機相分子相互作用的過程[30], 其中有機質在貝殼形成以及結構、性能方面起到至關重要的作用。有機質通過控制晶體形成、晶體結構、物相轉換等影響貝殼的性能。研究發現, 有機質在貝殼中的百分含量隨貝殼種類不同而不同, 扇貝和珠母貝貝殼的有機質含量分別為4.36%和5.24%[38]; 三角帆蚌與褶紋冠蚌貝殼粉平均有機質含量為0.903%, 蛋白質含量為1.64%[39]; 而香螺()[40]貝殼中的蛋白含量約為0.943%。本實驗中, 5種貝類貝殼有機質含量均為3%左右, 文蛤有機質含量最高, 占殼重的3.429%, 泥蚶有機質含量最低, 占殼重的2.461%; 其中蛋白質的相對含量在2.98%～7.21%, 泥蚶蛋白質含量最高, 占有機質的7.21%, 菲律賓蛤仔含量最低, 占2.98%。不同貝類貝殼或者同一貝類在不同環境、不同生長期、不同殼層, 其有機質的含量均有差異[41]。

4 結論

貝殼是絕大多數貝類防御保護的特殊結構, 而目前有關貝殼結構和成分的系統研究較為欠缺。本研究綜合應用掃描電鏡技術、X-射線粉末衍射技術和弱酸去鈣分析法對中國5種習見經濟貝類貝殼的斷面微觀結構、物相組成、有機基質和蛋白質含量進行了系統觀察和比較分析, 主要結論如下:

1) 它們的微觀結構不盡相同, 差異主要表現在晶體的組成和排列結構;

2) 它們的物相組成均由約97%的碳酸鈣和約3%的有機質組成;

3) 菲律賓蛤仔、文蛤、泥蚶和縊蟶4種貝殼無機相幾乎由文石組成, 而厚殼貽貝貝殼由文石和方解石組成;

4) 不同種類貝殼中總蛋白質含量差異較大, 可溶性蛋白含量顯著高于不可溶蛋白。

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Microstructure and composition analysis of five species of economic bivalves

MO Tian-bao1, 2, XU Hong-qiang3, HE Jing3, DONG Ying-hui2, LIN Zhi-hua2, 3

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources, College of Biological & Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China; 3. Ninghai Marine Biological Seed Industry Research Institute, Zhejiang Wanli University, Ninghai 315604, China)

Five popular species of marine bivalves,,,,, and, living off the east coast of China, were selected for shell structure characterization and chemical composition analyses using scanning electron microscopy, X-ray diffraction, and decalcifying in a weak acid. Scanning electron microscopy results showed that the shells comprised a prismatic layer and nacre layers. Additionally, the prismatic crystal structure included five types: fibrous prismatic, spherical prismatic, prismatic, homogeneous, and crossed lamellar layers.had only a fibrous prismatic layer, whilehad all types of layers except a spherical prismatic layer. These differences might be related to shell-crushing resistance. The nacre crystal structure contains nacreous and myostracum layers. The nacreous layer ofshowed an obvious layered structure that was a typical brick-mud structure, while the other four shells presented an irregular blocky structure. The X-ray powder diffractometry results showed two types of shells in the five mollusks, namely aragonite shells and calcite shells. In four species,,,, and, the inorganic phases were almost entirely composed of aragonite, while theinorganic phase was composed of aragonite and calcite. The organic matrix content in the five bivalves was approximately 3%, and the total protein content accounted for 2.98%–7.21% of the organic matrix, among which the content of soluble protein was 5.55–20.31 times that of insoluble protein. The information obtained from this study will provide a reliable scientific basis for biomineralization.

bivalves; shell; organic matter; SEM; XRD

Dec. 17, 2020

S91

A

1000-3096(2022)12-0041-09

10.11759/hykx20201217003

2020-12-17;

2021-03-03

國家重點研發計劃“藍色糧倉科技創新”專項課題(2018YFD0901405); 浙江省農業新品種選育重大科技專項課題(2021C02069-7); 寧波市重大科技攻關暨“揭榜掛帥”項目(2021Z114); 國家海洋水產種質資源庫項目

[National Key Research and Development Program of China, No. 2018YFD0901405; Zhejiang Major Program of Science and Technolo-gy, No. 2021C02069-7; Ningbo Major Project of Science and Technology, No. 2021Z114; National Marine Genetic Resource Center Program]

莫天寶(1995—), 男, 廣西玉林人, 碩士研究生, 主要從事貝類遺傳育種研究, E-mail: 191950530@qq.com; 林志華(1965—),通信作者, 研究員, E-mail: zhihua9988@126.com; 董迎輝(1980—), 通信作者, 教授, E-mail: dongyinghui118@126.com

(本文編輯: 楊 悅)