野化訓練中餌料源與放養密度對大黃魚生長、消化和免疫活性的影響

李紳豪，陳少波，李鵬全，秦 松，劉偉成

（1.上海海洋大學，上海 201306；2.浙江省海洋水產養殖研究所，浙江溫州 325005）

大黃魚Pseudosciaena crocea 屬硬骨魚綱Osteichthyes、鱸形目Percifomes、石首魚科Sciaenidae、黃魚屬Larimichthys，主要分布于東海、黃海南部以及南海的雷州半島東側水深80 m 以淺的沿岸近海水域，是暖水性近海魚類[1]。20 世紀50—70 年代大黃魚是東海最主要的經濟魚類之一。由于捕撈技術的高速發展，大黃魚被過度捕撈，資源產量嚴重減少。1974 年中國大黃魚產量為19.7×104t，而到20 世紀80 年代后期，總產量不足2.0×104t[2-4]。自1977 年起，大黃魚產卵場不能形成漁汛，到20 世紀80 年代中期，大黃魚最主要產卵場漁汛消失，大黃魚剩余群體已經消亡殆盡。

增殖放流是大黃魚資源修復的重要手段，但目前放流效果不佳，其原因主要包括以下三個方面：第一，人工配合飼料是魚苗最主要的餌料，食譜單一，且投飼量過于充足，魚苗捕食能力呈下降趨勢；其次，集約化養殖嚴重壓縮魚苗的活動空間，魚苗的運動機能下降；第三，魚苗在養殖池中環境條件單一，缺乏生物餌料信息、捕食者信息和水環境變化信息，致使其野外適應能力下降[5-6]。除了魚類自身的攝食需求，躲避天敵也是魚類在自然界提高生存幾率的重要能力之一。與養殖群體不同的是，野生魚類在自然界中由于經常面對天敵的追捕，具有躲避天敵的經驗與能力[7]，而人工飼養的魚類絕大多數都沒有接觸過天敵，缺乏面對天敵時的應對經驗與能力，導致養殖的魚類在自然界中很容易被天敵捕食[8-9]。因此，對魚類進行野化訓練是目前提高放流成活率的主要方法之一?？妆虻萚10]的赤眼鱒Squaliobarbus curriculus 江河人工放流前適應性馴養試驗表明，經過馴養后回捕率有較大提升。此外，對暗紋東方鲀Takifugu obscurus、羅非魚Oreochromis mossambicus 等[11-12]相關研究顯示，養殖飼料中某些成分可能會影響魚類生長、免疫和消化能力，且不同的投喂率會直接影響養殖對象腸胃內飼料的存量。在不考慮飼料利用率的前提下，在一定范圍內，投喂率越高，魚的腸胃內飼料量越多，消化代謝水平越高[8]。如紅鰭東方鲀Takifugu rubripes，在不同的投喂率下，胰蛋白酶活力、脂肪酶活力和肝臟丙氨酸氨基轉移酶活力隨飼料投喂水平增加而增加，而投喂率超過4%后，相關酶的活力沒有顯著性差異，且糜蛋白酶活力和血清尿素氮隨投喂水平增加逐漸降低[13]。目前國內外有關大黃魚的野化仍未見報道。本研究通過野化訓練時改變大黃魚的餌料源與放養密度，探討不同生長模式對大黃魚生長能力的影響，以期為今后大黃魚資源恢復提供有效借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚為浙江省海洋水產養殖研究所洞頭基地人工培育的苗種（閩-粵東族大黃魚）。選擇30 000 尾魚苗于海上魚排的網箱中暫養2 周，以適應自然海域環境。暫養過程中，每天分別在06:00 和16:00 各投喂飼料1 次，投喂至表觀飽食狀態。實驗地點位于浙江省溫州市洞頭區三排港海域。

本試驗所投喂的飼料是福州海馬飼料有限公司生產的海馬牌魚苗配合飼料，其主要成分包括進口魚粉、淀粉、豆粕、魚油、穩定型維生素與有機螯合礦物質。

1.2 試驗方法

暫養2 周后，隨機選取健康、大小均勻的初始體重為（1.65±0.34）g/尾的幼魚15 000 尾，隨機分為4 組，即對照組、高密度試驗組、中密度試驗組與低密度試驗組。每組放養數量與密度分別為對照組1 800 尾、80尾·m-3，高密度試驗組1 800 尾、80 尾·m-3，中密度試驗組900 尾、40 尾·m-3，低密度試驗組450 尾、20 尾·m-3。每組設3 個平行，分別飼養于規格為3 m×3 m×2.5 m 的試驗網箱中，網箱孔徑為5 mm×5 mm。在試驗期間，保持試驗組與對照組之間網箱距離足夠遠，防止試驗組的燈光效應影響對照組，同時試驗組停止人工配合飼料投入，每天18：00 將功率4 W 的充電式LED 燈泡放置于網箱底部，續航8 h，以燈光誘集生物餌料供幼魚捕食，調查發現生物餌料主要為橈足類（愛氏門足戎Thyropus edwardsi、粗糙東刺糠蝦Acanthomysis aspera li、丹氏紡錘水蚤Acartia negligens dana、普通波水蚤Undinula vulgaris、雙刺唇角水蚤Labidocera bipinnata tanaka、湯氏長足水蚤C.thompsoni、微刺哲水蚤Canthocalanus pauper、異尾寬水蚤Temora discaudata、羽小角水蚤Pontellina plumata、中華哲水蚤Calanus sinicus、中隆水蚤O.media 等），試驗中以浮游動物數量表述餌料豐度，餌料豐度為75 只·L-1。對照組每天分別在06:00 和16:00 各投喂飼料1 次，投喂至表觀飽食狀態，即養殖密度不影響魚苗攝食強度。試驗為期2 周。試驗期間，水溫為22.7～23.3 ℃，鹽度為29.5～29.6，pH 為8.1～8.3，溶解氧為6 mg·L-1以上。

試驗第7 天，每口網箱隨機選取30 尾魚，采用MS-222 麻醉，分別測定體質量、全長、體長、體高、體寬、尾柄寬等指標。試驗第14 天，試驗結束，停食24 h 后，從每口網箱中隨機選取30 尾魚，麻醉后立即低溫運輸至實驗室，再次測定體質量、全長、體長、體高、體寬、尾柄寬等指標。同時，每份樣品隨機選取6 尾魚在冰盤上解剖，分離肝臟和腸道組織，用4 ℃的生理鹽水沖洗后，吸干表面水分，分別放置于5 mL 凍存管中，并迅速放置于液氮中速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存，備測消化酶和抗氧化酶指標。

1.3 測定指標

1.3.1 測定指標1

生長指標包括增重率（WGR，%）、特定生長率（SGR，%·d-1）和肥滿度（CF，%）計算公式如下：

式中：m0為試驗開始時實驗魚的初始平均體質量，g；mt為結束時試驗魚的初始平均體質量，g；t 為試驗天數，d；w 為體質量，g；L 為體長，cm。

1.3.2 測定指標2

抗氧化酶和消化酶指標主要選取溶菌酶（LYM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、胃蛋白酶、α淀粉酶與脂肪酶等指標，六項酶活指標均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.4 數據處理

數據采用Microsoft Excel 軟件進行記錄，結果采用SPSS 19.0 進行統計分析，主要采用單因素分析各試驗因素之間的顯著性，顯著性水平設置為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 野化訓練對大黃魚生長的影響

經過野化7 d 與14 d 后大黃魚的生長情況如表1、2 所示，增重率與特定生長率如表3 所示。經過野化后，不同密度試驗組的全長差異不顯著（P＞0.05），但是體長、提高、體質量、尾柄寬與體寬均表現為低密度試驗組顯著高于中密度試驗組與高密度試驗組（P＜0.05），中、低密度試驗組之間的差異不顯著（P＞0.05）。特定生長率與增重率表現為低密度試驗組與對照組顯著高于高密度試驗組與中密度試驗組（P＜0.05），但是中、高密度試驗組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

表1 野化訓練7 d 后大黃魚不同組間生長情況對比Tab.1 Comparison of growth among different groups after 7 days of wild training of P.crocea

表2 野化訓練14 d 后大黃魚不同組間生長情況對比Tab.2 Comparison of growth among different groups after 14 days of wild training of P.crocea

表3 大黃魚不同組間生長情況參數始末對比Tab.3 Comparison of growth between different groups in P.crocea

2.2 野化訓練對大黃魚體形指標的影響

不同組別間大黃魚體形指標對比情況如表4 和表5 所示，實驗組大黃魚的體寬/體長、體高/體長和肥滿度均低于對照組，尾柄寬/尾長除高密度實驗組外其他2 個試驗組均高于對照組。

表4 大黃魚7 d 生理指標分析表Tab.4 Physiological index analysis table in P.crocea after 7 days

表5 大黃魚14 d 生理指標分析表Tab.5 Physiological index analysis table in P.crocea after 14 days

2.3 野化訓練對大黃魚抗氧化酶與消化酶活力的影響

不同組別間大黃魚肝臟中LYM、SOD、CAT 活性如表6 所示，腸胃中胃蛋白酶，脂肪酶與淀粉酶活性如表7 所示。在4 個組別中，LYM、SOD、CAT 的活性均表現為試驗組＞對照組，且除了SOD 的中密度組、高密度組及對照組外，均差異顯著（P＜0.05）。消化酶中除了淀粉酶外均表現為試驗組＞對照組，且除了胃蛋白酶的低密度組、中密度組及對照組以及脂肪酶的對照組、中密度組與高密度組外，其余均存在顯著性差異（P＜0.05）。

表6 大黃魚不同組間免疫酶活性對比Tab.6 Comparison of immune enzyme activities among different groups in P.crocea

表7 大黃魚不同組間消化酶活性對比Tab.7 Comparison of digestive enzyme activities among different groups in P.crocea

2.4 模型預測分析

在餌料豐度足夠的前提下，依據野化試驗結果，以餌料生物數量對比魚苗數量及終體質量之間的關系建立模型模擬分析，結果如表8 所示。

對表8 中數據進行分析，可得知在一定條件下，魚苗的終體質量與養殖密度成反比，與餌料生物密度正比。在低密度情況下，魚苗終體質量為一穩定值，表明魚苗攝食不受餌料供應限制，始終處于接近飽食的狀態。餌料利用率在低養殖密度時隨養殖密度的增加而增加，在高養殖密度時，餌料利用率趨向于穩定值。

表8 餌料-魚耦合野化模型在不同初始條件組合下系統運行考察指標的模擬結果Tab.8 Simulation results of system operation inspection indexes of shrimp-fish coupling domestication model under different initial condition combinations

3 討論

3.1 攝食條件的改變對大黃魚生長情況的影響

野化訓練是提高水生生物放流成活率的主要技術手段之一，該技術是馴化的一個逆向過程，旨在恢復水生生物的自然習性，以適應自然水域[14]。有學者認為，野化訓練能對魚類的增殖放流起到指導作用[15]，但是在食性與環境因子的野化選擇上，仍需要通過長期的案例研究進行理論驗證，同時需要大量實驗證實野化訓練觀察指標的合理性，從而篩選和優化觀察指標體系[16]。本試驗中主要采用自然過渡和適度干預的原則開展，將室內人工繁育的大黃魚苗種運輸至自然海域網箱中暫養，以適應自然海域生態環境，同時停止人工飼料投喂，通過燈光誘捕餌料生物的技術手段，輔助大黃魚完成從被動攝食到主動捕食的習性轉化，從人工飼料向天然餌料的食性轉化。有相關研究表明，個體越大的放流魚類（如黑龍江鱘魚）在自然環境中適應能力更強，捕食能力也更強，同時也就保證了其具有更大生存幾率，提高了放流幼魚的成活率[17]。本研究進行野化的大黃魚魚苗初始體長約44 mm、體質量1.65 g，野化14 d 后體長達到約55 mm、體重達到3.2 g，此階段魚苗屬于幼魚期。有調查顯示，16～50 mm 的大黃魚幼魚主要攝食中華假磷蝦、中華哲水蚤、糠蝦類以及箭蟲等，餌料尾長度平均為6.8 mm[18]。徐佳奕等[19]對大黃魚進行的食物組成和攝食習性結果顯示，大黃魚主要攝食十足類（IRI=49.14%）、魚蝦類（IRI=18.31%）和糠蝦類（IRI=2.34%）。在本試驗中，海區內誘捕到的餌料生物基本滿足大黃魚攝食需要。其它對魚類進行野化訓練的相關研究表明，瀾滄江土著魚類叉尾鲇的野化訓練后的生長形狀無顯著性差異[20]，人工飼養倒刺鲃幼魚經過15 d 的野化訓練后的生長無顯著差異，但是游泳能力顯著提升[21]。在本研究中，經過訓練后，試驗組大黃魚體質量優于對照組，體長顯著性大于對照組（P＜0.05），而硬骨魚類的游泳速度與體長正相關[22]，同時試驗組大黃魚特定生長率從1.30%～3.46%（7 d）

增長至2.98%～4.78%（14 d），而對照組從4.76%（7 d）下降至4.57%（14 d），說明經過訓練大黃魚具有更優的生長性能。對比訓練7 d 與14 d 后大黃魚的生理指標后發現，體高/體長、尾柄寬/體長、體高/體長與肥滿度均為試驗組低于對照組，此結果與王映等[23]在大黃魚養殖群體和野生群體形態、鱗片及耳石特征比較中結果相一致，表明經過野化訓練后試驗組較對照組形體更優。

本研究顯示，攝食天然餌料會對大黃魚的生長有一定的促進作用，同時不同的放養密度也會影響到大黃魚的生長，在低密度下大黃魚的生長情況較好。

3.2 野化訓練對大黃魚抗氧化酶與消化酶活性的影響

SOD、CAT 等抗氧化酶是動物機體內消除氧自由基的重要酶，在機體的氧化與抗氧化平衡中發揮重要作用。SOD 是抗氧化系統重要成員之一，它不僅能清除體內多余的自由基，降解溶酶體內的細菌及異物，還在免疫中發揮重要作用[24]。SOD 可催化機體內的超氧化物經歧化反應轉化為H2O 和H2O2，清除體內氧自由基，保護機體免受活性物質的損傷。CAT 可以加速物質的攝取和轉運，形成水解酶體系，破壞和消除侵入體內的異物，達到機體防御的功能，是評價動物生理代謝水平的一項重要指標[25]。LYM 活性也是一種重要的非特異性免疫的指標，良好的LYM 活性有助于魚類抵抗水域中各種病原物的侵襲[6]。T-AOC 是動物總抗氧化能力的綜合性指標，是機體抗氧化酶系統和抗氧化系統共同作用的結果，能夠反映機體對外界刺激的代償能力以及清除活性氧自由基的綜合能力[25]。一些研究表明，在環境中鹽度發生變化時，銀鯧Pacpus argenteus、鈍吻黃蓋鰈Pseudopleuronectes yokohamae 等魚類SOD 活性升高，使得2 種H2O2清除酶CAT 和GPX 的反應活性升高[25]。在本研究中，對大黃魚肝臟中的幾種酶活性進行測定后發現，試驗組中大黃魚肝臟組織LYM、CAT 與SOD 活性活力均高于對照組，說明通過改變攝食的餌料類型，大黃魚的免疫與應激能力強于投喂人工餌料的大黃魚。

有相關研究表明魚類體內的消化酶活性由食性決定，且其變化程度與食物的組成有一定的相關性。如肉食性魚類含有較高的脂肪酶和蛋白酶活性，而雜食性魚類比肉食性魚類表現出較高的淀粉酶活性，在雜食性魚類中，淀粉酶活性高于蛋白酶活性。一般情況下，肉食性魚類蛋白酶活性最高，草食性魚類的蛋白酶活性最低，其蛋白酶活性由強到弱的順序為：肉食性魚類＞雜食性魚類＞濾食性魚類＞草食性魚類[26]。本研究結果顯示，試驗組消化酶中胃蛋白酶與脂肪酶活性均高于對照組，淀粉酶活性低于對照組，說明經過訓練后大黃魚食性更偏向于肉食性魚類，有利于提高大黃魚的捕食適應能力。

總體而言，攝食天然餌料生物的試驗組大黃魚具有更優的抗氧化能力與免疫能力，且食性更偏向于肉食性，因此說明攝食天然餌料可以提高大黃魚的適應能力。

3.3 放養密度對大黃魚生長與免疫消化能力的影響

放養密度是一項影響魚類生長的重要環境脅迫因子。隨著密度的增加，單位體積內的溶氧、餌料、生存空間等因素都會發生改變。一些研究表明龍紋斑幼魚、銀鯧幼魚與雜交鱧等生長密度會影響魚類生長，表現在一定范圍內隨著野化訓練密度的上升，生長與免疫消化水平下降[27-29]。龍斑魚的密度實驗表明，養殖密度最終會影響到龍斑魚幼魚的體質量、日增重率與特定生長率等指標，兩者成反比關系，且在降低到一定密度之后影響開始變小，直至忽略不計。高放養密度對龍紋斑幼魚的生長存在著消極影響，而低密度的放養效果也不好[28]。對銀鯧幼魚的研究表明適當提升放養的密度可以改善銀鯧幼魚的生長情況，但在高密度放養時，銀鯧幼魚則會受到擁擠脅迫的影響，肝臟、腎臟中相關酶活力顯著升高[29]。一些學者對錦鯉Cyprinus carpio 的研究發現，提高養殖密度，會導致虹鱒Oncorhynchus mykiss 的溶菌酶活性快速下降，并在繼續升高密度后維持較低水平[30]。而對雜交鱧的研究結果表明，高密度放養會增加機體能耗，促進氧自由基的產生，最終導致丙二醛含量升高[27]。對俄羅斯鱘Acipenser gueldenstaedti 的結果顯示，隨著養殖密度的上升，SOD 活性下降[31]。對中華鱘Acipenser sinensis 的結果顯示，高密度下，SOD 活性下降[32]。在本研究中，低密度放養時大黃魚生長情況更優，總體表現為低密度試驗組＞中密度試驗組＞高密度試驗組，且各組各項指標之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。大黃魚高密度試驗組SOD 活性較中密度試驗組與低密度實驗組低，說明放養密度過高也會引起機體代謝失衡，造成細胞損傷，降低了機體的抗氧化能力?？傮w而言，不同放養密度下的大黃魚生長與消化酶及抗氧化酶活性指標存在差異，表現為隨著放養密度的上升，生長與胃蛋白酶及抗氧化酶活性下降。

3.4 最適養殖密度分析

整體而言，魚苗終體質量與餌料的利用率在一定程度上呈負相關，餌料生物被充分捕食而利用率較高時，魚苗通常不能飽食而導致終體質量降低；魚苗飽食而終體質量較高時，餌料生物由于未被充分攝食而導致利用率較低而產生浪費。魚苗終體質量反映的是產品質量指標，而餌料生物利用率反映的是系統經濟性指標，尋找二者之間的平衡點，在確保一定產品質量的情況下達成最高經濟性的初始條件組合即為最優組合。根據以上初始條件對餌料生物利用率及魚苗終體重的影響的分析，可判斷出二者同時呈高值時的初始條件應為養殖密度較低而網箱數量較高的情況。將不同初始條件組合下的魚苗終體重對餌料生物利用率作圖，結果如圖1 所示。

圖1 魚苗終體質量與餌料利用率的相關關系Fig.1 Correlation between fish fry weight and feed utilization rate

若設定魚苗終體重＞4 g 為終魚苗的質量標準，則圖1 中右上方的3 個數據點可滿足產品質量與資源利用效率均較優的要求，此3 個數據點的初始條件組合分別為表8 中的#9、#26 和#29 號組合，即魚苗密度20+餌料生物數量50 000、魚苗密度40+餌料生物數量100 000、魚苗密度20+餌料生物數量100 000 這3 個組合。這其中魚苗密度20+餌料生物數量100 000 的組合為最優，而3 個組合的共同點在于投放餌料生物數量與養殖魚苗總數量之比相同，均為約50:1。

整體而言，對大黃魚進行野化的最優密度應為：餌料/魚數量比約50:1。

4 結論

本研究進行大黃魚攝食試驗，通過對結果的分析與討論，可以得出如下結論：

（1）通過改變攝食天然餌料，大黃魚苗種生理指標均有顯著性的增長。攝食自然餌料的大黃魚特定生長率優于人工投喂的大黃魚，且體長顯著大于人工餌料投喂組。

（2）攝食天然餌料后，試驗組大黃魚的抗氧化酶活性指標更優，同時食性更偏向于肉食性，表明攝食訓練后大黃魚適應能力會有提高。

（3）放養密度不同會影響大黃魚的生長。生長情況與放養密度成負相關，即放養密度越低，生長情況越好。

（4）最適放養密度應選擇環境中餌料生物為放養大黃魚密度的50 倍。

因此認為，通過攝食天然餌料與降低生長密度的方式可以提高大黃魚的生存適應能力，從而提高大黃魚的放流成活率。