基于GEO芯片評價乳品中胰島素生長因子-I、維生素D3和雌二醇聯合對乳腺癌標志因子效應的研究

李金娟，張耀廣，李興佳，盧曼會，劉哲，趙海晴，李耘

（1.農業農村部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；3.石家莊君樂寶乳業集團，石家莊 050000）

0 引言

2020年世界衛生組織癌癥研究中心(IARC)發布癌癥研究報告指出，全球乳腺癌新發病例高達226萬例，約占所有新確診癌癥人數的11.7%，占女性新確診癌癥人數的24.5%，乳腺癌已然居女性癌癥發病率之首[1]。有研究指出患者攝入動物性食品（乳品，肉）比例與乳腺癌死亡率負相關，攝入動物性食品可提高癌癥病人免疫力，增加存活率[2]。隨著癌癥存活率的不斷提高，越來越多研究表明乳腺癌患者需要改善生活方式，補充各類常量、微量營養素以維持機體長期處于健康水平。此外，由于癌細胞增殖或遷移過程耗費大量營養素，造成病人缺乏多種營養素，經化療治療的癌癥病人尤其需要通過多種方式補充外源營養因子[3]。乳品是自然界中營養最全面的食物，富含蛋白質、脂類、乳糖及多種具抗癌功效的生物活性成分（如雌二醇、維生素D3、胰島素生長因子-I）[4]。已有研究證實提高日常乳品攝入比例可有效降低乳腺癌復發和遷移的幾率[5]。然而，迄今為止的研究數據還不足以給乳腺癌治愈患者提出具體的乳品補充建議。

本研究基于“物質-靶點”策略，以MCF-7細胞系為研究模型，預測分析乳品中典型營養物質雌二醇（E2）、維生素D3（VD3）、胰島素生長因子-I（IGF-I）聯合作用靶點，探究其對乳腺癌標志因子MUC1調控機制，為后期更加完整的功能實驗和機制研究進行奠基。

1 材料與方法

1.1 芯片篩選

通過GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）以E2、VD3、IGF-I為關鍵詞，限定物種為“Homo”，選擇基于MCF-7細胞系的效應芯片，選取基因芯片GSE160497、GSE27220、GSE26834，如表1所示。

表1 E2、VD3、IGF-I研究芯片

1.2 數據預處理和差異基因分析

利用R軟件中各芯片平臺的注釋包進行參考基因注釋，排除非E2、VD3、IGF-I作用樣本，并將探針名轉化為標準基因名；利用sva軟件包[8]進行批次效應消除，Limma數據包[9]篩選實驗組和對照組差異表達基因，篩選標準為P.Value＜0.05，差異倍數|log2FC|＞1。選出三芯片共表達基因，根據log2FC值進行排序。

1.3 PPI網絡構建及關鍵基因（DEGs）篩選

利用STRING[10]（http：//www.string-db.org）數據庫構建差異基因互作網絡，Cytoscape3.7.2[11]進行可視化處理。進一步利用MCODE插件（MCODE分數＞3）分析基因關聯度。模塊篩選標準：Degree Cutoff=2，Kcore=2,Maximum Depth=100,Node Score Cutoff=0.2。為了提高預測結果的可靠性，運用不同算法探索本研究關鍵基因（DEGs）并繪制熱圖。

1.4 基因功能富集和注釋

利用R軟件中的clusterProfiler[12]、pheatmap軟件包進行KEGG/GO功能富集分析及結果可視化，得到關鍵基因（DEGs）作用通路，篩選標準為pvalueCutoff=0.01,qvalueCutoff=0.05。

1.5 關鍵基因（DEGs）與乳腺癌生物標志物因子調控作用研究

利用CPDB數據庫（http://cpdb.molgen.mpg.de/CPDB/），分析關鍵基因（DEGs）與乳腺癌標志因子（MUC1）作用通路。

2 結果

2.1 差異基因篩選及PPI網絡分析

分別選取三芯片實驗組和對照組，進行基因篩選GSE160497（上調561，下調581）、GSE27220（上調12，下調35）、GSE26834（上調162，下調193）。應用sva軟件包進行批次矯正，限定|log2FC|＞1。根據log2FC值做降序處理，通過limma軟件包進行limFit差異分析獲得三芯片共表達基因157個，導入STRING繪制基因拓撲網絡，利用Cytoscape3.7.2優化處理。MOCODE插件篩選結果顯示，PPI網絡中存在2個重要的基因簇如圖1，表2所示，24個關鍵基因（DEGs）如圖2所示。

圖2 基于MOCED篩選的關鍵基因熱圖

表2 基于MOCED篩選的關鍵基因

圖1中陰影部分為基于MOCODE篩選的兩個DEGs簇。

圖1 3套芯片共表達差異基因PPI網絡

第1個基因簇關鍵cluster1有21個DEGs，DDX10(DEAD-box解旋酶10)、BRIX(核糖體生物發生器BRIX)、FEN1(活瓣核酸內切酶1)、UNG(尿嘧啶DNA糖基化酶)、DDX21(DEAD-box解旋酶21)、WDR4（WD重復域4）、CCNE1(細胞周期蛋白E1)、EXOSC2(外泌體成分2)、PAK1IP1(PAK1相互作用蛋白1)、GINS3(GINS復雜亞基3)、MCM10(微小染色體維持蛋白10)、RRP15(核糖體RNA加工15同源物)、MCM6(微小染色體維持蛋白6)、MCM7(微小染色體維持蛋白7)、MCM3(微小染色體維持蛋白3)、RRS1(核糖體生物發生調節因子1同源物)、CDT1(染色質和DNA復制因子1)、KIAA0020(Pumilio RNA結合家族成員3)、NOL6(核仁蛋白6)、CDC25A(細胞分裂周期激酶25A)、ORC6(起源識別復合物亞基6)。該基因簇主要功能為調節細胞周期、DNA復制以及染色體合成。

第2個基因簇cluster2有3個DEGs，ASNS（天冬酰胺合成酶）、CARS（半胱氨酰tRNA合成酶）、IARS（異亮氨酸-tRNA合成酶），該基因簇功能主要有促進氨基酸合成。

根據關鍵基因（DEGs）熱圖可知，當E2、VD3、IGFI作用于同一基因時，VD3對該類基因作用程度較弱，且E2與IGF-I對于同一基因的調控方向相反。

2.2 關鍵基因（DEGs）功能富集及通路分析

使用R軟件，對157個關鍵基因（DEGs）進行GO富集，主要包括生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）。根據基因富集數目與顯著程度，將P值做降序處理，篩選P＜0.01的GO條目，如圖3所示。

圖3 3套基因芯片共同表達顯著差異基因GO富集分析圖

結果顯示，E2、VD3、IGF-I主要作用DNA復制起始,ncRNA代謝過程等生物學過程，可影響細胞內蛋白質-DNA結構復雜化，核小體，DNA合成復雜化，以及微小染色體蛋白復雜化，具有影響RNA催化活性，DNA復制位點穩定的分子功能。

KEGG通路富集分析結果顯示，DEGs在DNA復制和細胞周期通路上顯著富集。

根據PPI網絡篩選出，E2、VD3、IGF-I主要通過MCM家族蛋白、RRP家族蛋白互相作用。因此根據CPDB數據庫篩選出MCM,RRP與MUC1復合蛋白作用最短通路，如圖4所示。

圖4 MCM家庭蛋白與MNC1互作通路

表3 3套芯片共表達差異基因KEGG信號通路分類

由于MCM3、MCM6、RRP15在E2作用下顯示下調，而MCM2、MCM7、MCM10在E2、VD3以及IGF-I作用下顯示出上調，因此適度補充E2可抑制MUC1的表達。

3 討 論

乳品營養成分超過2 000種，其中300多種可調節機體生長發育，維持乳腺癌患者術后代謝平衡，進而抑制乳腺癌遷移[4,13]。其中，胰島素生長因子-I(IGFI)是牛初乳中含量最豐富的生長因子，可調節血糖和膽固醇代謝，促進肌肉組織形成，具有延緩機體老化和功能[14]。研究證實乳品中的17-β-雌二醇(E2)介導IGF-IMAPK通路促進子宮發育，相反IGF-I可促進子宮肌層釋放E2，進而刺激子宮內膜腺上皮和間質增生，穩定機體激素代謝水平，預防促進性成熟[15]。此外，乳品還含有較多VD3，可調節血清鈣水平，相應的IGF-I可促進惰性的25-羥基維生素D轉化為活性1,25-羥基維生素D(VD3)，進一步促進成骨細胞發育[16]。然而，過量補充E2、VD3、I GF-I不僅會使機體代謝失衡，還可能會誘導乳腺癌調控基因過表達，增加乳腺癌遷移擴散的風險[17]。

為探究乳品中E2、VD3、IGF-I對乳腺癌標志因子的調控作用，本研究基于GEO數據庫篩選出與E2、VD3、IGF-I作用相關并獨立的3個芯片數據，采用生物信息學手段分析生理濃度下E2、VD3、IGF-I共同調節的信號通路，并挖掘該通路對乳腺癌標志因子的調控作用。結果表明，MCM10、MCM3、RRP15為E2（10 nmol/L）、VD3（0.5 nmol/L）、IGF-I（100 ng/mL）聯合介導的乳腺癌標志因子（MUC1）反應的關鍵基因。基因功能如下：(1)MCM家族蛋白：該家族蛋白具有結構相似、功能相似的特點。其中，MCM3可調節核苷酸庫的穩定性，調節新合成的MCM和親代MCM的平衡，進而保護基因組復制穩定性[18]。MCM10微小染色體維持蛋白10的作用是誘導DNA應激復制，調節復制叉延伸，促進S期細胞基因組復制等[19]。WeiDong Yang[20]等研究指出MCM10是乳腺癌治療的潛在預后標志物，其可通過Wnt/β-黏連蛋白途徑誘導乳腺癌轉移。因此，聯合暴露E2、VD3、IGF-I有乳腺癌遷移的風險。Takahiko Murayama[21]指出，E2可誘導c-Myc-MCM10表達降低，在保證正常細胞的生長率的同時降低乳腺癌干細胞生長率，這與本研究結果顯示一致如圖3所示。此外，Han Jeong Lim[22]研究指出，E2介導的MCM10反應可維持DNA復制延伸及細胞分裂的非冗余功能，確保胚胎著床、發育穩定，高劑量則會使桑葚期胚胎發育停滯。Mengying Zhang[23]等研究指出，低劑量E2有子宮營養作用，高劑量E2則會促進癌癥遷移。Mary Waterhouse[24]等指出VD3介導的MCM6反應可維持體重指數正常水平，根據個體發育水平及吸收率差異，應及時調整補充劑量，老年個體可適量補充VD3。本研究結果表明E2、VD3、IGF-I三者通過維持MCM家族蛋白平衡來控制DNA復制叉穩定性，使MUC1表達沉默。然而，E2單獨可使MCM3和MCM6表達沉默，E2與VD3、IGF-I聯合使用可使MCM2、MCM7和MCM10表達上調。因此，細胞微環境內若存在高濃度E2會導致MCM家族蛋白表達失衡，進而使MCM-MUC1信號通路過表達，增加罹患乳腺癌的風險。另有報道指出，E2可降低女性罹患乳腺癌的風險，但與其他藥物聯用(如高劑量異黃酮)可能通過其雌激素作用提高敏感個體的乳腺癌發病率，這與本研究結果顯示一致[25]。所以，E2為關鍵調控因素，并與VD3、IGF-I起互逆作用。(2)RRP15：核糖體RNA加工15同源物RRP15可干擾核仁應力，影響細胞核仁形成、核糖體生物效應，干擾G1-G1/S期細胞分裂，延遲S-G2/M期進展，最終導致細胞死亡[26]。有研究表明，RRP15可調控β-黏連蛋白與非編碼區RNA作用，進而調控癌細胞增殖[27]。Giorgio Giurato[28]等證實，E2介導的ERβ反應通過對細胞RRP15基因轉錄調控來抑制乳腺癌發生。Zhixiong Dong[26]等研究表明，生理濃度VD3作用使得MCF7細胞RRP15表達上調，致使細胞ATRChk1-gH2AX軸的DNA復制/損傷檢查反應被激活，延遲S-G2/M期進展，促進乳腺癌細胞發生自噬。Dan Hanson[29]等發現IGF-I缺乏可能導致RRP15-P53泛素化不足，進而導致機體發育不足，增加成年女性罹患乳腺癌的風險，補充生理濃度的IGF-I可有效降低患癌風險。本研究結果表明，生理濃度的E2、VD3、IGF-I共 同 調 節RRP15介 導 的TECRMUC1信號通路，通過TECR甾體還原酶作用細胞脂質代謝，下調乳腺癌標志因子MUC1的表達，降低乳腺癌發生的風險。

本研究運用多芯片聯合分析，發現MCM10、MCM3、RRP15是乳腺癌標志因子MUC1的關鍵調控基因。合相關數據再次驗證了在E2、VD3、IGF-I調控下的關鍵基因，可調節機體生長發育，同時具有抗癌效應。研究結果為闡明乳品中E2、VD3、IGF-I的聯合機制提供了新思路，也為篩選乳腺癌的治療藥物提供了新的靶點。但本研究的研究主體為乳源性E2、VD3、IGF-I，需要進一步實驗進行研究。不同批次乳品中多種營養成分含量層次不齊。乳腺癌患者或處于生長發育階段的青少年在食用乳品時，應謹慎攝入外源營養補充劑，以防其中的微量雌激素與乳品中其他營養素互作產生不良效應。