含有后生元和β-葡聚糖的乳飲料對小鼠免疫功能的影響

康宇鴻，何劍，趙六永，任新志，劉楓，郝靖宇，夏銳，李沙，田麗，楊華，陰文婭

（1.四川大學華西公共衛生學院華西第四醫院 成都 610044；2.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，呼和浩特 010110）

0 引言

免疫系統是機體執行免疫應答及免疫功能的重要系統。由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成。免疫系統具有識別和排除抗原性異物、與機體其他系統相互協調，共同維持機體內環境穩定和生理平衡的功能，免疫功能紊亂或者低下會使機體更容易受到病原體的侵害，從而增加患病風險[1]。機體可以通過先天免疫和適應性免疫兩種方式來識別和消滅入侵的病原微生物。

益生菌在免疫調節方面有積極作用[2-4]。功能食品和其他發酵產品中最常用的益生菌包括乳酸桿菌、雙歧桿菌和明串珠菌屬等[5]。益生菌的效能取決于活菌數以及腸道定殖效率，然而，在工業生產中，與食物基質有關的一些因素，如酸堿度、蛋白質、脂肪和碳水化合物濃度等，加工和儲存條件如時間、溫度、包裝材料等因素都可能降低益生菌細胞的生存能力[6]。相比之下，后生元[7]在工業生產中更穩定、更安全，對環境要求較低[8-9]，它在食品中的應用可能為食品制造商提供更多便利。

2021年5月，國際益生菌與益生元科學協會（International Scientific Association of Probioticsand Prebiotics,ISAPP）將后生元定義為“對宿主有益的無生命微生物和/或其成分的制劑”。已有研究證明后生元對機體的健康促進作用如治療和預防酒精引起的肝病、結腸炎、調節免疫系統和腸道微生物群等[9]。同時，β-葡聚糖作為一種機體免疫增強劑，具有調控機體免疫力和調節動物胃腸道微生態平衡的功能，同時具有抗氧化[10]、抗炎[11]、降血糖[12]等多種健康促進能力。

2021年5月17-23日是第七屆全民營養周。今年的宣傳口號是“健康中國營養先行”，傳播主題為“合理膳食營養惠萬家”。確保優質蛋白的攝入是合理膳食以及增強免疫力的重要膳食原則，而奶制品的攝入是保證優質蛋白攝入的重要途經。同時，健康問題受到越來越多國人的重視，這使得健康相關的功能食品有了發展空間。本次研究的樣品為含有后生元和β-葡聚糖的乳飲料，前期已有研究證明兩者對免疫功能調節的積極作用。

本文從細胞免疫、體液免疫、巨噬細胞功能和NK細胞活性四個方面就含有后生元和β-葡聚糖的乳飲料對小鼠免疫功能的調節作研究，為推廣含有后生元或/和β-葡聚糖的乳飲料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品與配制

內蒙古伊利實業集團股份有限公司提供含后生元和酵母β-葡聚糖的乳飲料凍干粉。樣品中的后生元和酵母β-葡聚糖含量見表1。

表1 樣品中的后生元和酵母β-葡聚糖含量（以240mL計）

稱取一定量的凍干粉末，加一定量的蒸餾水將其分別配制成4.69 g/100 mL、11.73 g/100 mL及28.16 g/100 mL的溶液，現配現用。給樣方式：經口灌胃，按照體重3 mL/100 g，每日一次。以人（60 kg）每日攝入一瓶240 mL的乳飲料計算，不確定系數為10，則小鼠（20 g）每日需攝入0.8 mL乳飲料。凍干樣品干物質含量為3.52%，0.8 mL飲品濃縮后干物質量為：0.8×3.52%=0.02816 g，則低劑量干預組的灌胃溶液濃度為4.69 g/100 mL，中、高劑量分別為低劑量的2.5倍和6倍，因此灌胃溶液濃度為11.73 g/100 mL及28.16 g/100 mL。

1.1.2 實驗動物及設計

BALB/c雄性小鼠，6～8周齡，18～22 g，SPF級，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司（生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001）。

將小鼠隨機分為4個免疫組。免疫一組：進行體重、臟器系數，碳廓清實驗；免疫二組：進行遲發型變態反應、血清溶血素測定、脾空斑形成實驗；免疫三組：進行脾淋巴細胞轉化實驗、NK細胞活性測定；免疫四組：進行吞噬細胞活性測定。4個免疫組分別設置樣低、中、高3個劑量組，同時設置空白對照組。干預組每日分別灌胃高、中、低劑量的（1408、3520、8448 mg/kg·bw）樣品溶液，空白組灌胃蒸餾水。所有動物連續灌胃30 d。每周稱量一次體重，并且根據體重調整灌胃量。

1.1.3 飼養管理

飼養于四川省疾病預防控制中心毒理所實驗動物中心SPF級動物房。適應性喂養5 d后開始實驗。SPF小鼠維持飼料（四川省人民醫院實驗動物研究所提供），動物飲水符合GB5749-2006的要求。實驗室溫為度20～26℃，日溫差≤4℃，相對濕度40%～70%，換氣次數10～20次/h，壓強梯度≥10 Pa，12/12 h明暗交替照明。

1.1.4 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度計,上海精科；生物顯微鏡,上海光學儀器廠；2010型酶標儀,德國ThermoFisher公司；離心機,德國Eppendorf公司；電子分析天平,德國賽多利斯公司；綿羊紅細胞-SRBC、SA緩沖液、新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；精致墨汁,北京一得閣墨業有限公司；PRMI1640培養基,美國Gibco公司。

1.2 實驗方法

遲發型變態反應實驗(足跖增厚法)、血清溶血素測定和抗體生成細胞檢測(改良玻片法)，脾淋巴細胞轉化實驗(MTT法)，NK細胞活性測測定，雞吞實驗，碳廓清試驗，以上實驗方法均參照《保健食品檢驗與評價技術規范(2003)》[13]。

1.2.1 統計學分析

2 結果與討論

2.1 乳飲料對小鼠體重及臟器指數的影響

實驗期間，各組動物體重穩定增長。各劑量動物初始體重和實驗末期體重與對照組相比較，無顯著差異（P＞0.05）。其中干預組第7天時，低、中劑量組體重顯著高于對照組（P＜0.05），第14天時，低、高劑量組體重顯著高于對照組（P＜0.05），結果見表2。與對照組相比較，各劑量組動物的脾臟及胸腺指數均無顯著差異（P＞0.05），結果見表3。

表2 不同濃度乳飲料對小鼠體重影響(,n=13)

表2 不同濃度乳飲料對小鼠體重影響(,n=13)

注：a表示與對照組比較，P＜0.05。下同。

樣品名稱 組別 第1天/g 第7天/g 第14天/g 第21天/g 第28天/g蒸餾水 對照組 20.1±0.9 20.6±1.1 21.5±1.2 22.4±1.3 23.4±1.4乳飲料 低劑量組 20.9±0.6 22.1±1.0a 22.7±1.3a 23.4±1.1 23.8±1.4中劑量組 20.1±0.4 21.8±0.9a 22.5±1.0 23.2±1.0 24.1±1.1高劑量組 20.3±0.9 21.6±1.3 22.9±1.5a 22.9±1.2 23.1±1.5

表3 不同濃度乳飲料對小鼠脾臟及胸腺指數影響(±s,n=13)

表3 不同濃度乳飲料對小鼠脾臟及胸腺指數影響(±s,n=13)

注：臟器體重比值=×100

樣品名稱 組別 終體重/g 脾臟 胸腺絕對重量/mg 脾臟體重比值 絕對重量/mg 胸腺體重比值蒸餾水 對照組 23.4±1.4 80.92±7.17 0.35±0.04 57.85±11.51 0.25±0.06乳飲料 低劑量組 23.8±1.4 78.38±9.79 0.33±0.04 59.62±11.82 0.25±0.06中劑量組 24.1±1.1 75.77±5.26 0.31±0.02 62.00±18.72 0.26±0.07高劑量組 23.1±1.5 74.46±6.36 0.33±0.04 45.77±16.27 0.20±0.08

2.2 乳飲料對小鼠細胞免疫功能的影響

與對照組相比較，各劑量組動物的淋巴細胞增值能力無顯著變化（P＞0.05），中、高劑量組的24 h足跖增厚有增加趨勢，其中高劑量組增加具有統計學意義（P＜0.05），結果見表4。

表4 不同濃度乳飲料對小鼠細胞免疫影響(±s,n=13)

表4 不同濃度乳飲料對小鼠細胞免疫影響(±s,n=13)

樣品名稱 組別 ConA誘導脾淋巴細胞增殖能力 24 h足跖增厚/mm蒸餾水 對照組 0.15±0.07 0.72±0.21乳飲料 低劑量組 0.17±0.08 0.72±0.20中劑量組 0.17±0.06 0.86±0.12高劑量組 0.19±0.09 0.95±0.19a

2.3 乳飲料對小鼠體液免疫功能的影響

與對照組相比較。干預組小鼠的脾空斑形成數均增多，其中低、高劑量組增多有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比較，干預組的抗體積數均未有顯著性改變（P＞0.05），結果見表5。

表5 不同濃度乳飲料對小鼠體液免疫影響(±s,n=13)

表5 不同濃度乳飲料對小鼠體液免疫影響(±s,n=13)

樣品名稱 組別 脾空斑形成數（/106脾細胞） 抗體積數蒸餾水 對照組 210.00±16.07 152.31±24.47乳飲料 低劑量組 241.92±27.88a 151.62±29.35中劑量組 217.69±37.06 159.31±24.47高劑量組 269.62±59.88a 154.77±23.29

2.4 乳飲料對巨噬細胞功能的影響

與對照組相比較，干預組各劑量組的吞噬率和吞噬指數沒有顯著差異（P＞0.05），結果如表6所示。與對照組相比較，干預組各劑量組小鼠的終體重、肝臟重量、吞噬指數沒有顯著差異（P＞0.05），結果如表7所示。

表6 不同濃度乳飲料對小鼠巨噬細胞功能影響－雞吞實驗(±s,n=13)

表6 不同濃度乳飲料對小鼠巨噬細胞功能影響－雞吞實驗(±s,n=13)

樣品名稱 組別 吞噬率/% 吞噬指數蒸餾水 對照組 21.31±2.05 0.83±0.02乳飲料 低劑量組 23.15±1.99 0.84±0.03中劑量組 23.19±3.65 0.84±0.04高劑量組 22.88±1.98 0.82±0.03

表7 不同濃度乳飲料對小鼠巨噬細胞功能影響－碳廓清實驗(±s,n=13)

表7 不同濃度乳飲料對小鼠巨噬細胞功能影響－碳廓清實驗(±s,n=13)

名稱 組別 體重/g 肝臟重量/mg 脾臟重量/mg 吞噬指數樣品蒸餾水 對照組23.4±1.4 80.92±7.17 4.92±0.98乳飲料 低劑量組23.8±1.4 78.38±9.79 4.91±0.54中劑量組24.1±1.1 75.77±5.26 4.48±0.51高劑量組23.1±1.5 1051.54±100.68 1044.23±101.06 1058.23±93.25 1000.31±148.73 74.46±6.36 5.15±1.01

2.5 乳飲料對NK細胞活性的影響

與對照組相比較，干預組的中、高劑量組NK細胞活性率有顯著增高（P＜0.05）。結果見表8。

表8 不同濃度乳飲料對NK細胞活性的影響(±s,n=13)

表8 不同濃度乳飲料對NK細胞活性的影響(±s,n=13)

樣品名稱 組別 NK細胞活性率/% 轉換值蒸餾水 對照組 16.52±10.50 0.41±0.13乳飲料 低劑量組 14.49±7.37 0.38±0.11中劑量組 26.87±9.28a 0.54±0.10a高劑量組 26.47±11.28a 0.53±0.14a

3 結論

研究表明，乳飲料的低、高劑量組的脾空斑形成數均明顯增加，反映了樣品在體液免疫上有一定作用。樣品的中、高劑量組NK細胞活性顯著增高，反映樣品對非特異性免疫的改善有一定作用。

后生元中的非活性微生物細胞較益生菌可能表現出更強的安全性，即降低敗血癥和抗生素耐藥性的風險，以及技術和實踐益處，即更長的保質期，因為微生物已經失去活力，具有穩定性，因此可以不需要冷鏈運輸。這些特征也使其能夠在發展中地區應用。更為重要的是，已證明后生元可調節動物和人類的抗炎和陽性免疫應答。后生元能夠通過增加免疫球蛋白、激活巨噬細胞等途徑來增強特異性和非特異性的免疫應答[13]。

幾項研究調查了后生元對免疫系統反應的影響。例如，Chuang等人檢測了3種熱滅活乳桿菌菌株對小鼠脾細胞增殖和小鼠樹突狀細胞活化的影響，證明了其調節白細胞介素分泌的有效性[17]。Lopez等人證明在人上皮性結直腸腺癌Caco-2細胞系中，紫外線滅活的鼠李糖乳桿菌GG細胞在鞭毛蛋白誘導下可減少IL-8的產生[18]。據報道，鼠李糖乳桿菌ATCC7469的熱滅活細胞均能夠誘導小鼠巨噬細胞合成具有促炎（TNF-α和IL-6）或調節(IL-10)功能的不同細胞因子[19]。最近有研究評估了熱滅活短乳桿菌KCCM12203P細胞與其活對應物相比的抗氧化活性和免疫刺激潛力[20]，發現熱滅活短乳桿菌KCCM12203P細胞有更高的抗氧化活性且擁有免疫刺激潛力。

免疫力下降是眾所周知的老齡化后果，可能導致老年人易患呼吸道感染[21]。在一項對老年受試者的隨機安慰劑對照雙盲試驗中，Kotanietal.證實經口攝入戊糖乳桿菌b240的熱滅活細胞可誘導唾液免疫球蛋白A(sIgA)分泌增加，sIgA在介導體液粘膜免疫應答中發揮關鍵作用[22]。而且，口服攝入戊糖乳桿菌b240對老年人普通感冒發揮保護作用（降低其發病率）與這種后生元通過增強sIgA的分泌改善黏膜免疫的能力有關。接受補充膳食的老年組的總體幸福感也有所增加，這與普通感冒無關，因此表明食用后生元會產生其他有益作用[23]。Murata等人最近觀察到，攝入熱滅活副干酪乳桿菌MCC1849細胞在內的飲食在易患普通感冒的年輕健康成人受試者亞組進行研究引起了相似的效應（即使在精神壓力條件下也可改善對普通感冒感染的抵抗力和維持理想的情緒）[24]。也已在健康成人（包括有限的老年受試者亞組）中證明了熱滅活植物乳桿菌L-137細胞促進的免疫功能增強與健康相關生活質量(QOL)改善之間的嚴格關系[25]。

β-葡聚糖作為一種可溶性膳食纖維，具有多種健康促進能力。本研究中的酵母β-葡聚糖的體外益生元效應研究結果表明，其在一定程度上能夠抵抗胃酸和人體消化酶的水解，利于有益菌群提前進入對數生長期，且能夠促進益生菌增殖，是一種具有潛在應用價值的益生元[26]。酵母β-葡聚糖已被多項臨床研究證明其能提高免疫力健康[14-16]。

后生元和β-葡聚糖的協同作用在生物體內已有體現。Mahmoud[27]等人研究了熱滅活植物乳桿菌和β-葡聚糖對魚類的生長性能、飼料利用、健康狀況的影響，發現在試驗條件下，日糧中添加熱滅活植物乳桿菌和β-葡聚糖對提高紅鯛的生長、消化率和免疫應答具有顯著的協同作用。

本次研究樣品為含有后生元和β-葡聚糖的乳飲料，雖然有研究曾將酵母β-葡聚糖作為增稠劑加入到脫脂酸奶中，結果顯示，酸奶的總體喜好評分有顯著增加[29]。但研究牛奶中強化β-葡聚糖對免疫功能的影響的文章鮮少，在一項雙盲，隨機，對照，前瞻性試驗中，食用包含二十二碳六烯酸，益生元和低聚半乳糖以及酵母β-葡聚糖的配方奶粉兒童的白細胞介素10和白細胞增加，表明抗炎機制和免疫細胞效應子增加[30]。綜上，在牛奶中同時添加益生菌和β-葡聚糖與免疫功能的改善有一定關系，與本次研究的結果一致。因此可見，研究添加了后生元和β-葡聚糖的牛奶有一定現實意義。

以上研究結果顯示，在本實驗條件下，給BALB/c小鼠灌胃含有后生元和酵母β-葡聚糖的乳飲料樣品后，其體液免疫功能和NK細胞活性改善效果明顯，提示該受試樣品可能具有增強免疫力的潛在功效。